植物組織培養(yǎng)全過程

1、1蝴蝶蘭植物組織培養(yǎng)全過程一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的原理和方法；2了解植物組織培養(yǎng)的方法；3學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的原理；4了解不同濃度BA對(duì)蝴蝶蘭生根的影響；5了解煉苗的作用；6掌握訓(xùn)化的方法步驟；7觀察蝴蝶蘭組織培養(yǎng)到種植的全過程，并注意其中出現(xiàn)的問題。二實(shí)驗(yàn)原理：蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屆植物，因花型奇特、色彩艷麗、花期長(zhǎng)久而享有“洋 蘭皇后”的美譽(yù)。蝴蝶蘭原產(chǎn)于緬甸、菲律賓、臺(tái)灣、馬來(lái)西業(yè)、印度尼西業(yè)等 熱帶業(yè)洲地區(qū)，具有極高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是國(guó)際上最具商業(yè)價(jià)值的四大觀賞 熱帶蘭之一。蝴蝶蘭屆單莖性氣生蘭，再生能力弱，很難進(jìn)行分株繁殖，且種子無(wú) 胚乳，自然條件下難以萌發(fā)，增殖系數(shù)低，難

2、以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。應(yīng)用植 物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行蝴蝶蘭快速繁殖可以縮短繁育周期，獲得大量成株，并可以保持優(yōu)良性狀，維護(hù)種質(zhì)資源，是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑。在以蝴蝶蘭根尖、 莖尖、葉片和花梗芽為外植體誘導(dǎo)原球莖時(shí)，由于根尖的誘導(dǎo)率低，摘取莖尖會(huì)損 失母株等原因，因此在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中根和莖都不是誘導(dǎo)原球莖的理想材料。 而蝴蝶蘭葉片和花梗芽作為外植體誘導(dǎo)圓球莖時(shí)，其誘導(dǎo)率較高、對(duì)母株傷害不 大，是較為理想的外植體材料。三材料與用具:蝴蝶蘭的莖尖、1/ 2MS +BA2. 5 mg/L +NAA0. 2mg/L花梗腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基、1/ 2 MS+ BA3. 5 mg/L + KT1. 0 m

3、g/L + NAA0. 5 mg/L +椰乳10咐曾殖 培養(yǎng)基、母液、量筒、燒杯、玻璃棒、移液管、無(wú)菌水、高壓滅菌器、容量瓶、pM式紙、75%酉精、2咖氯酸鈉、鑲子、解剖刀、超凈工作臺(tái)、95%酉精、穴盤等。四方法與步驟(1)母液的配制根據(jù)需要的母液量配制母液，配好后要貼好標(biāo)簽，以防弄錯(cuò)。標(biāo)簽上要注明是什 么母液和母液的稀釋倍數(shù)。將配好的母液進(jìn)行儲(chǔ)藏，要用的時(shí)候可以方便使用。配制培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)注意：1在使用提前配制的母液時(shí)，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動(dòng)盛放 母液的瓶子，2如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰 這種母液，重新進(jìn)行配制；2用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的

4、母液將量筒 或移液管潤(rùn)洗2次；(2)培養(yǎng)基的配制花梗腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L增殖培養(yǎng)基為1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1.0 mg/L + NAA0. 5 mg/L +椰乳10 %。3生根培養(yǎng)基為1/ 2MS + BA1.5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L香蕉泥以上培 養(yǎng)基 p H 均為 5. 5注意事項(xiàng):1、配制培養(yǎng)基時(shí)要注意母液的倍數(shù)，濃度；計(jì)算時(shí)要仔細(xì)不要看錯(cuò)。2、量取母液時(shí)，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳希咳?種，劃掉1種，以免出錯(cuò)。3、 在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，

5、操作者千萬(wàn)不能離開，否則沸 騰的久了，就需要重新稱量、制備。4、 調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaO唾液或1 mol/L的 稀鹽酸，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試 紙(5.47.0)測(cè)培養(yǎng)基的pH,一直到培養(yǎng)基的pH為5.5為止。5、培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時(shí)，先將培養(yǎng)基 倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中。注意不要讓培養(yǎng)基沾 到瓶口和瓶壁上，培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時(shí)封蓋瓶口。3、在高壓滅菌時(shí)，要正確使用高壓滅菌器。加水時(shí)水要沒過電熱絲，在第一次到108度時(shí)要進(jìn)行放氣，讓鍋里的冷空氣放出。之后要將溫度保持在121度,時(shí)間

6、為20分鐘。20分鐘后要等到指針為0時(shí)，才能打開鍋蓋。(3)材料消毒與接種1、 切下其帶芽莖段，長(zhǎng)約2 - 3cm ,用自來(lái)水活洗干凈，再在75%酉精中浸泡40秒；然后用無(wú)菌水活洗一次；再在2%次氯酸鈉中浸泡15分鐘，浸泡時(shí)不斷攪 動(dòng)；再用無(wú)菌水活洗兩次。2、 在整理活洗材料的同時(shí)對(duì)超凈工作臺(tái)進(jìn)行消蠹，消蠹時(shí)間為20分鐘。3、 消蠹完成后，將莖段置丁超凈工作臺(tái)上，先用75%勺灑精消蠹30s，無(wú)菌 水活洗2次。4、 經(jīng)無(wú)菌水沖洗數(shù)次，將帶芽莖段接種到經(jīng)設(shè)計(jì)的不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上。5、接種好后，貼上標(biāo)簽，并將其放到培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。分別在不同培養(yǎng)條件每天光照12 h ,光強(qiáng)1 600Lx

7、,溫度25 2C下培養(yǎng)后觀察 結(jié)果。(4)生根壯苗接種在1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L培養(yǎng)基. 上的外植體在培養(yǎng)320 d后開始初步形成原球莖，此時(shí)進(jìn)行第1次轉(zhuǎn)接。接下來(lái)較長(zhǎng)時(shí)間(約40 d)內(nèi)，原球莖進(jìn)一步發(fā)育完全，此過程也需轉(zhuǎn)接2次。從莖尖培養(yǎng)開始至60 d后觀察發(fā)現(xiàn)，污染率為零，外植體成活率高達(dá)90. 9，原球莖的誘導(dǎo)率為87.6.培 養(yǎng)60 d，轉(zhuǎn)接3次后，將初代培養(yǎng)中未形成原球莖的植株去掉，將誘導(dǎo)生成的 生長(zhǎng)較快的原球莖分割成小的組織塊。小的組織塊經(jīng)過12個(gè)月培養(yǎng)后乂形成原球莖，將其接種在相同的N培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。如此反復(fù)切割增殖，實(shí) 現(xiàn)了原

8、球莖的增殖。此過程需約30 d的時(shí)間，其間需要3次轉(zhuǎn)接。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā) 現(xiàn)，原球莖的再生能力很強(qiáng)，經(jīng)過切割后的原球莖在新的培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)了增殖， 不但每個(gè)外植體平均分化出3. 4個(gè)植株，并且形成3. 4個(gè)原球莖，原球莖的形 成率達(dá)到100。生根壯苗階段關(guān)鍵在丁嚴(yán)格篩選激素的種類和濃度，一般需降低培養(yǎng)基的 激素含量，以便形成健壯苗。常用的生長(zhǎng)素有IBA(0.31.5mg/L)、NAA(0.10.8mg/L)。添加GA30.1mg/L + NAA0.1mg/L的組合能明顯提高生根率，且植株健壯，長(zhǎng)勢(shì)好。蝴蝶蘭屆熱帶氣生蘭，具氣生根栽培上要求根部通氣良 好?，F(xiàn)在蝴蝶蘭移栽常用基質(zhì)有水苔、椰糠、蛇木、樹皮等

9、 ，以水苔效果較好。 綜上所述，用組培方法快繁蝴蝶蘭較傳統(tǒng)繁殖方法有3個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)：節(jié)省育苗用地；節(jié)省繁殖材料，提高繁殖系數(shù)；利用莖尖脫蠹培養(yǎng)，挽救因受 病蠹侵染而退化的優(yōu)良品種，提高質(zhì)量和欣賞價(jià)值?？傊M培快繁技術(shù)可大大 提高生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益。(5)煉苗經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的溫室培養(yǎng)，必須經(jīng)過煉苗后才能移栽盆中.煉苗的目的是促使 幼苗適應(yīng)外界氣候環(huán)境，使移栽苗的成活率增高。其方法為，在蝴蝶蘭成苗時(shí)， 移栽前5天左右，在要進(jìn)行移栽的溫室內(nèi)將封口膜打開1/3左右，使幼苗與空氣 有一定接觸。2天后，移栽到馴化溫室內(nèi)，使幼苗完全暴露在空氣中，要適當(dāng)遮 陽(yáng)，避免高溫和強(qiáng)光直接照射，3天后即可移栽。移栽時(shí)將幼

10、苗取出，放在1000倍的多菌靈水溶液中小心洗去根部的培養(yǎng)基，去掉老葉，放入鋪有濕報(bào)紙的盒子， 要注意保濕。栽培基質(zhì)為經(jīng)過高溫消蠹后的苔鮮，用鑲子劃痕后，火住幼苗根部， 插入至第1輪葉，用手小心壓緊，用薄膜覆蓋，保持溫度在21一25C,相對(duì)濕 度60% 80%控制好水分和溫度，移栽成活率可達(dá)90%以上。(6)洗苗經(jīng)過煉苗后，還要進(jìn)行洗苗。洗苗需要用20 C左右的溫水，認(rèn)真活洗2 3遍，保證將培養(yǎng)基等物質(zhì)沖洗干凈。苗洗凈后，要晾干。(7)移栽與管理1、栽培基質(zhì)：由丁蘭花大多數(shù)都喜潤(rùn)而畏濕，要求通氣通風(fēng)和適當(dāng)?shù)乃郑?因此，基質(zhì)要用蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖能吸水，乂能排水， 既能透氣乂有 養(yǎng)分的材

11、料。常用基質(zhì)有：水苔、泥碳土、椰糠、珍珠巖、木炭等.栽培蝴蝶蘭 以水苔為最佳，其成分比例為泥炭薛3/4、珍珠巖和木炭1/4。將基質(zhì)洗凈后， 用潔凈溫水浸泡1 d,使其充分吸水膨脹，柔軟舒展。移苗前輕輕擠出水苔中的 部分水分，以顏色發(fā)白為度。2、溫度多數(shù)洋蘭適溫為1522 C,而蝴蝶蘭的最適溫度為2028 C;蘭花既怕高 溫，乂怕嚴(yán)寒，因此對(duì)其溫度一定要重視，不宜過高，但也不宜過低。3、光照光照、溫度和濕度為蘭花生長(zhǎng)的三要素，它對(duì)蘭花生長(zhǎng)發(fā)育的影響是很重要 的蘭花的4需光量也是隨種類而異。此外，在蘭花的培養(yǎng)中，均需適宜的遮陰。季 節(jié)不同，遮陰度也不同，春、秋季需遮50的光，夏天需遮70 9/6的光，而在 冬季則不需遮。.4、水分大多數(shù)蘭花生丁多雨但排水良好的環(huán)境中，故性喜濕潤(rùn)而怕過多的水分滯 留。但不同種類的蘭花對(duì)水分的需求并不相同， 在栽培時(shí)不可混在一起。蝴蝶蘭 是一種厚葉的附生蘭，具有耐旱的生理特點(diǎn)。對(duì)丁這一類蘭花，只要水溫適宜， 澆灌得法，白天和黃昏澆水都是可以的。澆水應(yīng)以能濕潤(rùn)根為度，不可多水，即 使是水苔失水發(fā)白，也不應(yīng)急丁澆水。總之，要適合蘭花既怕久旱乂忌積水，喜 歡濕潤(rùn)，干而不燥的特性。5、濕度剛出瓶的蘭苗對(duì)空氣濕度的要求較高，一般應(yīng)控制在8090 9/6以上， 可在浴器上再加上塑料薄膜，其目的是保持濕度。但是，長(zhǎng)期高濕對(duì)形成壯苗不 利，可逐漸增大覆蓋縫