基于靶標 IDO1、TDO 的抑制劑研究進展

1、基于靶標 IDO1、TDO 的抑制劑研究進展 董俊敏, 劉站柱* (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所, 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室, 北京 100050) 摘要：吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1 (IDO1) 和色氨酸 2,3-雙加氧酶 (TDO) 催化色氨酸代謝的第一步也是限速步驟，與腫瘤免疫耐受和患者的不良預(yù)后相關(guān)，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的重要靶標。到目前為止，有 9 個 IDO1 抑制劑、3 個 IDO1 / TDO雙靶點抑制劑進入臨床試驗。本篇綜述從藥物化學(xué)角度總結(jié)了IDO1抑制劑、TDO抑制劑、IDO1 / TDO 雙重抑制劑的研究進展。 關(guān)鍵詞：吲哚胺 2,3-雙加氧酶

2、 1；色氨酸 2,3-雙加氧酶；免疫治療；抑制劑；構(gòu)效關(guān)系 色氨酸是蛋白質(zhì)合成所必須的氨基酸，對維持細胞的功能至關(guān)重要。體內(nèi)超過 95%的色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝為犬尿氨酸、犬尿酸、喹啉酸和輔酶NAD+等 。該途徑的第一步也是限速步驟，由吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1 (IDO1)、吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1 (IDO2) 和色氨酸 2,3-雙加氧酶 (TDO) 催化。三者都是包含血紅素的酶，具有不同的結(jié)構(gòu)、組織分布和生物學(xué)功能。IDO1 是單體酶，廣泛分布在哺乳動物的組織、器官和細胞中；可被炎性刺激 (如干擾素-) 誘導(dǎo)；催化 L-色氨酸、D-色氨酸和各種吲哚胺類衍生物的轉(zhuǎn)化；與色氨酸的

3、非飲食分解代謝和免疫防御相關(guān)。IDO2 與 IDO1 有 43%的序列同源性，主要分布在腎小管、肝臟和精子中，色氨酸降解活性低，作用機制仍不太明確。而 TDO 是一個四聚體結(jié)構(gòu)，主要分布在哺乳動物的肝臟中，受刺激后，也可以在胎盤、睪丸和大腦等其他組織中檢測到；TDO 具有高度的選擇性，優(yōu)先與 L-色氨酸結(jié)合；可被色氨酸、糖皮質(zhì)激素和犬尿氨酸誘導(dǎo)；負責(zé)調(diào)節(jié)全身的色氨酸水平，并在癌癥免疫學(xué)中起到類似的作用。色氨酸的耗竭和犬尿氨酸等代謝物的產(chǎn)生導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生免疫抑制作用，促進癌細胞的免疫逃逸。研究表明 IDO1 和 TDO 在多種癌癥細胞如乳腺癌、宮頸癌、腦癌等上調(diào)表達，與腫瘤的侵襲性和患者的不

4、良預(yù)后相關(guān)，其抑制劑已成為癌癥免疫治療的新策略。本文回顧了 IDO1 和 TDO 介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸的機制和各自獨特的結(jié)構(gòu)，從藥物化學(xué)角度總結(jié) IDO1 抑制劑、TDO 抑制劑和 IDO1 / TDO 雙重抑制劑的研究進展。1 IDO1 和 TDO 介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸的機制IDO1 和 TDO 催化色氨酸分解代謝，可以維持機體正常的免疫反應(yīng)幅度和持續(xù)時間, 防止健康細胞產(chǎn)生不受抑制的免疫激活。但在噁性腫瘤中 IDO1 和 TDO 的表達上調(diào)，導(dǎo)致色氨酸耗竭和下游產(chǎn)物的積累，創(chuàng)造了一個免疫抑制微環(huán)境，使腫瘤細胞逃避有效的免疫應(yīng)答。主要包括以下 3 條路徑 (圖 1) ：色氨酸的耗竭活化 GCN-

5、2 激酶，導(dǎo)致其下游靶標 e IF-2 磷酸化和衰減，導(dǎo)致效應(yīng) T細胞 (Teff) 在 G1 周期增殖停滯。 色氨酸的耗竭抑制 m TOR 所介導(dǎo)的分子應(yīng)激反應(yīng)，誘發(fā) Teff 細胞自噬。色氨酸的分解代謝物犬尿氨酸與內(nèi)源性芳烴受體 (AhR) 的結(jié)合，導(dǎo)致 Treg 細胞選擇性分化增殖；同時阻止輔助性 T 細胞17 (Th17) 的成熟，進而抑制 DC 細胞的浸潤和細胞毒性 T 細胞的免疫反應(yīng)。值得注意的是，IDO1 涉及到這三種效應(yīng)途徑，而 TDO 的免疫作用主要歸功于活化 GCN-2 通路和與 AhR 的結(jié)合。除了色氨酸和犬尿氨酸誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答外，喹啉酸、3-羥基犬尿氨酸等代謝物的產(chǎn)生還

6、會影響巨噬細胞的轉(zhuǎn)化，抑制 NK 細胞的增殖和功能，這些路徑共同介導(dǎo)局部和/或全身性的免疫抑制作用，促進腫瘤細胞的存活和轉(zhuǎn)移。2 IDO1 和 TDO 的結(jié)構(gòu) IDO1是包含血紅素鐵的單體氧化酶，分子質(zhì)量約為45 kDa，可以分成兩個結(jié)構(gòu)域 (圖2A)，大的結(jié)構(gòu)域 (口袋A) 是由13個-螺旋 (G-S) 和2個310螺旋組成；4個長螺旋 (G、I、Q、S) 與其他3個短螺旋 (K、L、N) 共同構(gòu)成血紅素結(jié)合口袋；小的結(jié)構(gòu)域 (口袋B) 由6個-螺旋 (A-F)、兩個短-折疊和3個310螺旋構(gòu)成。 TDO 是由分子質(zhì)量在 3545 kDa 的單體組成的同型四聚體酶，從細菌到人類結(jié)構(gòu)都非常保守

7、。hTDO 單體由 15 個 螺旋組成，可以被分成 3 個主要的區(qū)域 (圖 2B)N 端區(qū)域 (a1a3)、大結(jié)構(gòu)域 (a4a9、a13、a14) 和小結(jié)構(gòu)域 (a10a12、a15)。4 個單體 (AD，圖 2C) 通過 3 個相互垂直的雙向軸關(guān)聯(lián)，相連兩個單體的相互作用力更強，其中兩個 C 形二聚體 (AB 和 CD) 彼此垂直地被夾緊而形成緊密的四聚體。 hTDO 和 hIDO 總體氨基酸序列同源性雖然只有 10，但它們的大結(jié)構(gòu)域顯示相似的折疊，可以共享相對保守的活性位點區(qū)域，小結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)和空間方向有所不同 )?？傊?，這些結(jié)構(gòu)可以幫助人們更深入的了解酶與底物結(jié)合、催化的分子機制，也

8、為設(shè)計新型的 IDO1 和 TDO 抑制劑提供了幫助。3 臨床進展 3.1 進入臨床研究的 IDO1 抑制劑 對 IDO1 選擇性抑制劑的研究已引起醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，相關(guān)專利文獻已經(jīng)報道了數(shù)千種化合物，但還沒有抑制劑上市。表 1 為處于臨床研究階段的 9 個小分子化合物，其中已知的結(jié)構(gòu)式如圖 3，這些化合物除了作為單體使用，還可以和化學(xué)療法、免疫檢查點療法、放射療法等聯(lián)合使用，相關(guān)文獻對聯(lián)合用藥的臨床進展進行了詳細的綜述。3.2 進入臨床研究的 IDO1 / TDO 雙重抑制劑 TDO 和 IDO1 在某些腫瘤的表達是重疊的，因此探索 TDO 抑制劑、IDO1 / TDO 雙重抑制劑具有合理性

9、。目前尚未有選擇性 TDO 抑制劑進入臨床研究，有3 個 IDO1 / TDO 雙重抑制劑已進入臨床研究階段 (表 2)，均由中國制藥公司研發(fā)，但具體的結(jié)構(gòu)并未公開。 4 新型抑制劑研究進展 4.1 IDO1 抑制劑 2003 年，Van den Eynde 首次證明 IDO1 與癌癥相關(guān)，在學(xué)術(shù)界和制藥公司興起一股熱潮來尋找新穎的抑制劑骨架。已有研究者對 IDO1 抑制劑進行了詳細的綜述，下文將根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)類型對最新研究結(jié)果進行綜述。 4.1.1 咪唑結(jié)構(gòu) NewLink 基因公司從 4-苯基咪唑 (7，圖 4，IC50 = 48 mol·L-1) 出發(fā)得到的化合物 NLG-9

10、19 (5，IC50 = 28 nmol·L-1) ，目前已經(jīng)進入到臨床期研究階段，用于實體瘤的治療。咪唑并5, 1-a異吲哚母核增加了分子的剛性，改善了生化和細胞效能。分子對接顯示 NLG-919 母核的 2-位氮原子直接與血紅素的鐵原子配位，三環(huán)骨架通過范德華力與口袋 A 上的殘基 Val130、Phe163、Phe164 和 Leu234 緊密連接，11-位羥基可以與丙酸血紅素形成氫鍵，環(huán)己醇部分則伸向口袋 B，末端羥基參與形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這些相互作用有助于生物活性的提高。對 NLG-919 衍生物 8 (IC50 = 38 nmol·L-1) 的研究進一步闡明了廣泛的

11、疏水相互作用和獨特的氫鍵網(wǎng)絡(luò)有利于提高咪唑異吲哚衍生物的抑制活性。2019 年，Tu 等報道了對 NLG-919 側(cè)鏈的改造：用不同環(huán)狀基團取代側(cè)鏈，活性均下降或失活，只有苯基哌啶基取代維持相似的活性。合成并評估了一系列取代的哌啶基，手性分離得到對映體 9 (IC50 = 9.7 nmol·L-1) 活性最好。9 沒有羥基不能形成氫鍵，但側(cè)鏈可以更深地插入口袋 B 中，甲基吡唑環(huán)與殘基 Arg231 之間存在的陽離子- 相互作用使其成為更有效的抑制劑。綜上，苯基咪唑骨架是研究 IDO1抑制劑的良好起點，咪唑并5,1-a異吲哚作為一類新的藥效團結(jié)構(gòu)，仍具有廣闊的研究空間。2020 年，

12、Serafini 等基于 IDO1 結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了苯并咪唑類化合物 10 (圖 5，IC50 =16 nmol·L-1)，對 10 進行系列的結(jié)構(gòu)修飾，構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下：苯并咪唑 1-位 N 與血紅素鐵離子直接作用，被移除活性消失；5-位被 Br 原子取代，增加與口袋 A 的親和力，保持活性；仲酰胺的 NH 參與 IDO1 活性位點內(nèi)關(guān)鍵氫鍵的形成，被取代活性下降；右側(cè)為吡咯環(huán)時活性最好，吡咯環(huán)上的 NH 可以和血紅素形成氫鍵，溴原子可以與殘基形成鹵素鍵，被取代或移除活性均下降。所選化合物 (1013) 在幾種腫瘤細胞中顯示納摩爾水平的抑制作用，沒有明顯的細胞毒性。化合物 1

13、2 的體外代謝穩(wěn)定性要優(yōu)于 11、13，在體外相同時間內(nèi)，分別殘留 65%、32%、59%的底物；靜脈注射 12 后，小鼠血漿中犬尿氨酸水平在 2 min 內(nèi)迅速下降，并在 30 min 內(nèi)保持在基礎(chǔ)水平以下，證明 12 在體內(nèi)也是有效的。但體內(nèi)半衰期 (t1/2 = 0.65 h) 很短，需要優(yōu)化藥代動力學(xué)參數(shù)?？傊?12與已知的 IDO1 抑制劑相比，在化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性位點的構(gòu)成、合成的可行性上展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢。基于 IDO1 / Amg-1 的晶體結(jié)構(gòu)，Tojo 等對 Amg-1 (14，圖 6) 進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到咪唑并噻吩類化合物，其中化合物 15 (IC50 = 77 nmol

14、3;L-1) 活性最高。2018年 Griglio 等和 2019 年 Serafini 等保持 15 的咪唑并噻唑骨架和對溴苯基部分不變，對側(cè)鏈進行了修飾和生物學(xué)評估。咪唑氮與血紅素鐵配位，對溴苯基插入口袋 A 中，與周圍殘基發(fā)生疏水相互作用，側(cè)鏈則插入口袋 B 中。化合物 1619 IDO1 酶學(xué)抑制活性最高，IC50在 0.20.8 mol·L-1之間，但仍較 15 要弱。遺憾的是，這一類化合物對細胞膜的滲透性低，在體外 A375 細胞實驗中沒有顯示IDO1 的抑制性。4.1.2 N-羥基脒結(jié)構(gòu) Incyte 公司的臨床候選化合物 pacadostat (2, IC50 = 7

15、3nmol·L-1) ，目前正在進行期臨床試驗，用于多種癌癥的治療。但數(shù)據(jù)顯示epacadostat 在體內(nèi)被代謝酶UGT1A9 轉(zhuǎn)化為 O-葡萄糖醛酸共軛化合物 20 (圖 7)，半衰期只有 2.5 h，疏水性比較差 (CLog P = 0.09)，口服生物利用度不盡滿意 (大鼠和靈猴口服生物利用度分別是 11%、33%)。因此，有必要對 epacadostat 進行結(jié)構(gòu)修飾，發(fā)現(xiàn)藥效和藥動學(xué)性質(zhì)更佳的化合物。 Meng 課題組在 4 位側(cè)鏈引入一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)以增加分子的空間位阻，使其完全占據(jù)口袋 B，通過調(diào)節(jié)環(huán)狀同源物的電子和空間效應(yīng)來研究構(gòu)效關(guān)系。但改造的效果不是很理想，只有少部

16、分化合物保持納摩爾活性?；衔?21、22通過環(huán)化末端氨磺酰胺部分得到，化合物 23、24是在磺酰胺基團和噁二唑環(huán)之間引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它們在 HEK293 細胞實驗中保持與 epacadosta 相似的活性，IC50在 16.868.59 nmol·L-1之間。值得注意的是，化合物 23 與 epacadosta 相比，藥動學(xué)性能顯著提高，半衰期延長至 3.82 h，大鼠口服生物利用度達 33.6%。同時在 CT-26 同系異種移植模型中，口服化合物 23 與 epacadostat 具有相似的治療效果，適合作為先導(dǎo)化合物進一步開發(fā)。 2020 年，Steeneck 等將 epacad

17、ostat 側(cè)鏈的 NH 用 S 原子取代，得到 S-EPA (25, IC50 = 130 nmol·L-1)，細胞活性較 epacadosta 提高了 3 倍。對 S-EPA 進行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)口袋 A 處苯環(huán)上取代基的極性變化對活性有顯著的影響；側(cè)鏈末端具有磺酰胺基可以提高效能和代謝穩(wěn)定性。優(yōu)選的化合物 26 (IC50 = 21 nmol·L-1) 在人源化肝小鼠模型中，葡萄糖醛酸化代謝作用明顯降低。Du 等用磷酰胺基團代替epacadostat 的磺酰胺基團得到一系列含磷酸氨基酯的化合物，其中化合物 27 (IC50 = 104 nmol·L-1，HeL

18、a IC50 = 10.1 nmol·L-1) 展示了良好的IDO1 抑制活性，與 epacadostat 對 Lewis 細胞的肺轉(zhuǎn)移實驗有同等的抑制活性 (77%的抑制率)，但半衰期短、口服生物利用度也未提高。 其他 N-羥基脒類化合物還有 28、29，用苯并噁二唑環(huán)代替苯環(huán)，生物活性保持在納摩爾水平, IC50分別為 80、59 nmol·L-1?？傊?，N-羥基脒是這類化合物強抑制活性的關(guān)鍵藥效團。在對 epacadostat 的結(jié)構(gòu)修飾方面，重點是在保持細胞活性的同時降低體內(nèi)葡萄糖醛酸化代謝速率來改善藥代動力學(xué)性質(zhì)。4.1.3 聯(lián)苯羧酸類 近年來，Jure-Kunk

19、el 課題組通過高通量篩選得到聯(lián)苯羧酸類化合物 30 (圖 8，IC50 = 0.087 mol·L-1) ，通過四唑基團等位取代羧基、取代基的優(yōu)化等，得到化合物 31 (HeLa IC50 = 4 nmol·L-1) 活性最佳。分子 32 (HeLa IC50 = 13 nmol·L-1)與 hIDO1 晶體結(jié)構(gòu)對接顯示：羧基的氧原子與血紅素鐵形成六配位，苯環(huán)占據(jù)了口袋 A，二異丁基氨基和對甲苯脲部分延伸到口袋 B 中，尿素的兩個 NH 都與血紅素的丙酸基團形成氫鍵?；诖?，2020 年，Cai 等用萘環(huán)或苯并五元雜環(huán)取代化合物 32 的苯環(huán)并保留羧基，評估體內(nèi)

20、外 IDO1 的抑制活性。這類化合物構(gòu)效關(guān)系顯示：羧基和脲基是保持活性所必需的基團；左側(cè)芳環(huán)自身的電子云密度對活性影響較大，其上有鹵素基團可以更好地提高親脂性。萘環(huán)系列活性最好的化合物是 33 (HeLa IC50 = 2.6 nmol·L-1)，苯并五元雜環(huán)系列活性最好的是 34 (HeLa IC50 = 12.8 nmol·L-1)?；衔?33 在 MTT 實驗中并未顯示細胞毒性，在小鼠體內(nèi)抗腫瘤研究中，作為單體使用效果與 epacadostat 相當 (抑制率為 53.9%)，與 5-氟尿嘧啶合用時，抑制率高達 92.8%，值得進一步的研究。 4.1.4 醌類結(jié)構(gòu)

21、醌類化合物大多來源于天然產(chǎn)物及其衍生物。近年來，新的天然產(chǎn)物被報道。2015 年，Blunt 等發(fā)現(xiàn)異噻唑苯醌天然產(chǎn)物 aulosirazole (35，IC50 = 0.08 mol·L-1) 和 ronqodine A (36， IC50 = 0.13 mol·L-1) 都是有效的IDO1 抑制劑。 2019 年， Pan 等從細極鏈格孢菌 (Alternaria enuissima) DFFSCS013 中分離出 3 個新型蒽醌類化合物：anthrininone B、C (37、38) 和 39，具有明顯的 IDO1 酶抑制活性，IC50分別是 4.2、0.5、1.7

22、 mol·L-1，但在 HEK293細胞中，10 mol·L-1的濃度也沒有產(chǎn)生抑制活性。值得注意的是，天然醌結(jié)構(gòu)是細胞內(nèi) NQO1 等還原性輔因子的有效底物，歷經(jīng)細胞內(nèi)輔因子依賴的氧化還原循環(huán)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，會限制醌類化合物在高濃度下使用。 2018 年，Pan 等設(shè)計合成了 60 個新型萘醌衍生物，對 A、B 環(huán)進行不同的改造，構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下: 2 位被 4-吡啶基或 4-咪唑基取代活性最好，吡啶基或咪唑基上有任何的取代基活性下降；在 1,4-萘醌的 C-5 或 C-8 位引入 N 原子活性下降；B 環(huán)是噻唑環(huán)比咪唑環(huán)活性要好。選擇兩個活性最高的化合物 40 (I

23、C50 = 26 nmol·L-1)、41 (IC50 = 18 nmol·L-1) 進行深入研究。40、41 可使大鼠血漿中犬尿氨酸水平分別下降 50.1%和 30.5%，同時在其對 IDO1 的有效抑制濃度下均無細胞毒性 (在 MTT 毒性實驗中，CC50 > 20 mol·L-1)，這兩個化合物被選作先導(dǎo)化合物進行更進一步的研究。4.1.5 吲哚結(jié)構(gòu) 在過去的幾十年中，大多數(shù)色氨酸類似物被證明可以作為 IDO1抑制劑。最經(jīng)常使用的就是 1-甲基-色氨酸 (1-MT, 42, 圖 10)，現(xiàn)在多作為化學(xué)工具研究 IDO1 的生物學(xué)作用。1-MT 和低氧細

24、胞毒素替拉扎明 (TPZ) 的雜合分子 43 (Ki = 76.3 mol·L-1) ，首先作為低氧細胞毒素起作用，然后它們的代謝產(chǎn)物 TPZ - NO 雜合物作為 IDO1 抑制劑，具有獨特的作用模式。含有 D-1-MT的 Pt (IV) 復(fù)合物 44 和 45 作為免疫化療劑，可以促進 T 細胞增殖，促進免疫調(diào)節(jié)作用。2017 年，Crosignani 等開發(fā)出琥珀酰亞胺類化合物 PF-06840003 (4，IC50 = 0.41 mol·L-1)，用于治療 IV 級膠質(zhì)母細胞瘤或 III 級間變性膠質(zhì)瘤，正在進行 I 期臨床試驗，PF-06840003 與大多數(shù) I

25、DO1 抑制劑不同，它不與血紅素鐵結(jié)合，而是通過與 hIDO1 形成高密度氫鍵發(fā)揮作用。總體來說，這一類化合物值得進一步研究癌癥影像學(xué)、癌癥免疫化學(xué)療法等新應(yīng)用。 4.1.6 其他結(jié)構(gòu) BMS (百時美施貴寶) 公司開發(fā)的 MS-986205 (3, IC50 = 1.7 nmol·L-1)，與 PD-1 抑制劑nivolumab 聯(lián)合用藥, 處于臨床期研究階段。值得注意的是，MS-986205 是與不含亞鐵血紅素的 IDO1 蛋白結(jié)合，具有獨特的結(jié)合模式。分子對接顯示：苯環(huán)占據(jù)口袋 A，與 Tyr126 形成-相互作用；酰胺上的 NH 與 Ser167 形成氫鍵；環(huán)己烷作為連接基團

26、將喹啉環(huán)導(dǎo)向一個新的疏水性口袋；喹啉環(huán)與 Phe270 形成-相互作用；喹啉上的氮原子與 Arg343 形成氫鍵。這種結(jié)合模式，為抑制劑的設(shè)計提供了新的思路。此外，非天然產(chǎn)物來源的化合物 (4648, 圖 11)，IC50分別是 36 nmol·L-1、0.22 mol·L-1、151 nmol·L-1，為 IDO1 抑制劑提供了多樣性的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)實驗中能夠抑制腫瘤的生長。2019 年，Xu 等采用虛擬篩選的策略，結(jié)合相似性搜索和分子對接方法發(fā)現(xiàn)了氰基吡啶骨架化合物，分子對接顯示：嘧啶環(huán)中的腈基直接與鐵血紅素結(jié)合，嘧啶環(huán)位于口袋 A 中，另一個芳環(huán)占據(jù)口袋 B中

27、，其中化合物 49 (IC50 = 84 nmol·L-1) 活性最好。 4.2 TDO 抑制劑 與 IDO1 相比，TDO 雖然在 1930s 年就被發(fā)現(xiàn)，但直到 2011 年，一項腦腫瘤研究才正式將 TDO 與癌癥聯(lián)系起來，使該酶成為有興趣的藥理學(xué)靶標。目前針對 TDO 的類似研究仍處于初始階段，只有少量的 TDO 抑制劑被報道。下文對有代表性的結(jié)構(gòu)進行簡要概述。 4.2.1 吲哚結(jié)構(gòu) 自 TDO 發(fā)現(xiàn)以來，少數(shù)基于吲哚骨架的化合物被發(fā)現(xiàn)具有 TDO抑制活性。1995 年，Salter 等58開發(fā)了一系列 3-(2-(吡啶基)乙烯基) 吲哚類化合物作為 TDO / 5-羥色胺再攝

28、取組合抑制劑用于治療抑郁癥，其中 68OC91 (50，圖 12，IC50 = 0.28 mol·L-1)，它對肝臟提取的 TDO 具有出色的體外抑制活性 (Ki約為 30 nmol·L-1)。但溶解度低，生物利用度差，未進行更深入的研究。2011 年，Dolusic 等將 68OC91 與 XcTDO (野油菜黃單胞菌 TDO) 進行分子對接，顯示吲哚的 NH 基團與殘基 His55 形成 H 鍵穩(wěn)定吲哚環(huán)，3-吡啶基向活性位點的入口突出，并與殘基 Thr254 的 NH 形成 H 鍵?；诖四Ｐ停珼olusic 合成了 70 多個類似物，在細胞水平測定 TDO 的抑制活

29、性。構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下：吲哚骨架是保持活性所必需的結(jié)構(gòu)，NH 參與形成氫鍵，不可被取代；母核 5 位或 6 位被 F 取代或沒有取代基時活性最佳；連接鏈為反雙鍵或炔鍵可以保留活性；3 位側(cè)鏈引入帶負電荷的基團，可與殘基通過氫鍵作用增加溶解度而不影響穩(wěn)定性。盡管得到了相對完整的構(gòu)效關(guān)系，但仍無法顯著提高該系列化合物的 TDO 抑制活性。含四唑基團的 LM10 (51，IC50 = 0.62 mol·L-1) 和含羧基的化合物 52 (IC50 = 3 mol·L-1)，活性較 50 稍弱，但具有改善的理化參數(shù)，表現(xiàn)為低親脂性 (log D7.4分別為 0.2 和 0.6)、高溶

30、解度和高穩(wěn)定性，特別是 LM10，具有高的口服生物利用度。LM10 因其高選擇性、高活性成為最具潛力的候選藥物，在臨床前實驗中還顯示出有效的抗腫瘤活性。 2016 年 Abdel-Magid 等合成了一系列 3-吲哚衍生物，以化合物 53 (A172 IC50 = 27 nmol·L-1) 和 54 (A172 IC50 = 26 nmol·L-1) 細胞水平活性最好。但重要特性如溶解度、生物利用度和抗腫瘤活性的結(jié)果未公開。4.2.2 萘三唑二酮結(jié)構(gòu) 2015 年，Wu 等采用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法得到苗頭化合物 55 (圖 13, IC50 = 711 nmol·

31、;L-1)，包含萘三唑二酮的核心結(jié)構(gòu)，具有潛在的 TDO 抑制活性。當去掉芐基或者對萘三唑二酮結(jié)構(gòu)進行修飾，均使活性消失，證明核心結(jié)構(gòu)和苯基與血紅素和周圍殘基的相互作用是保持活性的重要原因，該類化合物構(gòu)效關(guān)系研究集中在對苯環(huán)的修飾，在 N-芐基的對位和間位引入剛性叔酰胺可顯著提高對 TDO 的抑制作用。其中化合物 56 (IC50 = 30 nmol·L-1) 的抑制活性最高。分子對接發(fā)現(xiàn)，55 和 56 的萘三唑二酮和苯基結(jié)構(gòu)高度重疊，與血紅素基團和周圍殘基具有相似的配位和疏水相互作用，但 56 的 N-甲基哌嗪酰胺基團與殘基 Arg144 形成額外的氫鍵增強了 TDO 的抑制活性

32、。同時，56 對 TDO抑制活性比 IDO1 抑制活性 (IC50 = 640 nmol·L-1) 高 21 倍，高選擇性的原因是56 無法與 IDO 中的殘基 Arg231 (TDO 中的相應(yīng)殘基 Arg144) 相互作用。根據(jù)上述結(jié)果，設(shè)計與 hTDO 中殘基 Arg144 相互作用的化合物將是提高 TDO 抑制劑活性和選擇性的有效方法?；衔?56 是第一個通過基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選鑒定的新型 TDO 抑制劑，需要進一步評估其作為癌癥治療劑的潛力。2019 年，Hua 等提出將 TDO 抑制劑引入 Pt (IV) 復(fù)合物的策略。通過釋放順鉑以損傷 DNA 的方式誘導(dǎo)癌細胞死亡，同時

33、生成 TDO 抑制劑阻斷 TDO 蛋白的表達，促進 T 細胞增殖并殺死癌細胞，提高化療藥物的治療效果。復(fù)合物58 (IC50 = 1.06 mol·L-1) 與 57 (IC50 = 5.23 mol·L-1)、順鉑 (IC50 = 3.85 mol·L-1) 相比，在 MTT 實驗中展示了最強的細胞毒性。同時 58 具有適中的 TDO 酶抑制活性 (IC50 = 0.85 mol·L-1)，在 qRT-PCR 實驗中可以有效下調(diào) TDO 蛋白的表達，阻斷犬尿氨酸的產(chǎn)生，促進 T 細胞增殖，顯著改善腫瘤免疫微環(huán)境。相關(guān)方法的協(xié)同作用及相關(guān)的強化機制有待于

34、繼續(xù)研究。4.2.3 氨基異噁唑結(jié)構(gòu) 2018 年 Pei 等通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)苗頭化合物 4-苯基-5-氨基異噁唑 59 (圖 14)，SW48 細胞 EC50為 85 nmol·L-1，從異噁唑環(huán)氨基的修飾、苯環(huán)的取代或替換、異噁唑的替換三方面對 59 進行修飾 (圖 14)。構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)：5-氨基異噁唑結(jié)構(gòu)是抑制 TDO 所需的核心結(jié)構(gòu)，替換活性降低；苯環(huán)的取代或替換 (化合物 6062) 對活性影響程度較小，其中以化合物 62 (SW48 EC50 = 77 nmol·L-1) 細胞活性最好。62 對 TDO 的選擇性是 IDO1 的 6 倍，酶實驗沒有觀察到對細胞

35、色素 P450 的抑制作用，并且在全血的穩(wěn)定性更高。總之，這一類化合物存在全血中穩(wěn)定性不高的問題，未來研究應(yīng)明確其不穩(wěn)定的原因以及與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。 4.2.4 其他結(jié)構(gòu) 1961 年，氧化還原活性化合物如兒茶酚、對苯二酚、對苯醌、L-二羥基苯丙氨酸和 L-腎上腺素被發(fā)現(xiàn)作為 TDO 抑制劑。2014 年，Pantouris等篩選了將近 2 800 種化合物，采用 hTDO 酶促分析方法鑒定了 7 種有效的TDO 抑制劑，其抑制常數(shù) (Ki) 在納摩爾或低微摩爾范圍內(nèi)，但沒有報告這些TDO 抑制劑的 IC50值。其中黃酮類化合物 NSC36398 (63，圖 15) 對 TDO 的 Ki約為 16

36、 mol·L-1，而對 IDO1 的 Ki值超過 100 mol·L-1，是選擇性最好的化合物，可以進行進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。2018 年，Zhang 等評估了天然產(chǎn)物色胺酮 64 (IC50 = 3.94 mol·L-1) 和衍生物潛在的 TDO 抑制活性，其中化合物 65、66 的酶活性分別是 0.937 和 0.1 mol·L-1，相較于 IDO1 有良好的選擇性 (分別是 38 倍和 88 倍)。構(gòu)效關(guān)系表明：8 位是吸電子基團活性要優(yōu)于給電子基團；2 位、7位、9 位被取代不利于 TDO 抑制活性。分子對接顯示色胺酮環(huán)通過 O-Fe 配位作用和疏水

37、相互作用直接結(jié)合到 hTDO 的活性位點?；衔?65 和 66 具有發(fā)展成為新型 TDO 抑制劑并應(yīng)用于 TDO 相關(guān)靶標治療的潛力。2020 年，Parr 等根據(jù)IDO1 選擇性抑制劑 NLG-919 (5，IDO1 EC50 = 0.45 mol·L-1; TDO EC50 = 2.0 mol·L-1) 的結(jié)構(gòu)，保留骨架咪唑并異吲哚，對側(cè)鏈進行結(jié)構(gòu)改造。當側(cè)鏈為四氫苯并噁二唑 67 (IC50 = 0.054 mol·L-1)、N-稠合四氫吡唑并吡啶 68 (IC50 = 0.13 mol·L-1)、四氫苯并吡啶 69 (IC50 = 0.05 m

38、ol·L-1) 時具有較高的 TDO 選擇性和抑制活性。在肝微粒體和肝細胞中，有適中的代謝穩(wěn)定性。4.3 IDO1 / TDO 雙重抑制劑 2018 年，ECHO-301 (IDO1 抑制劑 epacadostat 與 PD-1 檢查點抑制劑pembrolizumab 聯(lián)合用藥) 用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的期臨床實驗以失敗告終。實驗失敗的原因一方面可能是藥效學(xué)指標不適用或藥物組合策略不匹配。另一方面可能是對 IDO1 在生理病理中的確切調(diào)控機制以及對腫瘤微環(huán)境等的影響了解的不夠深入，epacadostat 選擇性阻斷 IDO1 的表達，但 TDO 通路可以發(fā)揮潛在的代償作用引

39、起腫瘤免疫抑制效應(yīng)。因此開發(fā)組合或泛型 IDO1 / TDO 抑制劑，可以克服選擇性 IDO1 抑制劑在臨床試驗中的不足，擴大癌癥治療的適用范圍。下文對文獻中有代表性的結(jié)構(gòu)進行闡述。 4.3.1 吲哚結(jié)構(gòu) 2019 年 Cui 等通過對數(shù)據(jù)庫隨機篩選發(fā)現(xiàn)了具有 2-羧酸吲哚骨架的新型 IDO1 / TDO 雙重抑制劑 70 (圖16，IDO IC50 = 40.7 mol·L-1；TDO IC50 = 99.2 mol·L-1) 和 71 (IDO IC50 = 35.6 mol·L-1；TDO IC50 = 22.5mol·L-1)，以其為先導(dǎo)化合物進

40、行廣泛的結(jié)構(gòu)修飾，總結(jié)構(gòu)效關(guān)系如下 (圖 16)：2-羧基吲哚骨架和 4 位 NH 連接鏈是保持活性所必需的結(jié)構(gòu)；骨架 7 位修飾空間有限，甲基、氰基、硝基等取代時活性消失，只有 F 原子和甲氧基取代保持活性；6 位乙酰氨基或乙胺基通過氫鍵促進與 IDO1 或 TDO 的結(jié)合，增加活性；4 位連接鏈上苯環(huán)的取代方式及取代基的性質(zhì)對活性影響較大，苯環(huán) 3位上是-F、-OCH3、-CH3等小的疏水性基團有利于活性，苯環(huán) 4位上是氫鍵受體如 F 或 O 原子可增加與酶的親和力。化合物 72 (IDO IC50 = 8.4 mol·L-1；TDO IC50 = 8.84 mol·L

41、-1) 和IDO1 / TDO 酶的分子對接顯示 2-羧基吲哚骨架位于血紅素頂部的口袋中，結(jié)構(gòu)修飾空間非常有限；而在 4 位的芳香族基團可以延伸到環(huán)和 IDO1 中殘基 Arg231 (TDO 中殘基 Arg144) 周圍的區(qū)域，具有一定的靈活性，可增加結(jié)構(gòu)多樣性。在A172 細胞中，化合物 73 (IDO IC50 = 3.18 mol·L-1；TDO IC50 = 7.12 mol·L-1) 是最有效的抑制劑，在濃度為 100 mol·L-1時抑制率為 77.7%，在濃度為 50 mol·L-1時抑制率為 55.9%，在 10 mol·L-

42、1時可以促進 T 細胞增殖，但活性遠比 NLG-919要弱。值得注意是，Cui同時鑒定了化合物72的衍生物74 (IDO IC50 = 18 nmol·L-1；TDO IC50 = 25 nmol·L-1)，一類新型的醌衍生物，對 IDO1 和 TDO 的抑制性更高，IC50 值均達到納摩爾水平。這一發(fā)現(xiàn)可以用于指導(dǎo)進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以開發(fā)活性更強的 IDO1 / TDO 雙重抑制劑。 4.3.2 吲唑結(jié)構(gòu) Qian 課題組之前研究的吲唑類化合物 LWQ-84 (75，圖 17, IC50 = 5.3 mol·L-1) 具有弱的 IDO1 抑制活性，沒有 TDO

43、的抑制活性，在細胞 (HeLa細胞和 A172 細胞) 實驗和CT26 異種移植模型中幾乎沒有抗癌作用。2019 年，該課題組以 LWQ-84 為先導(dǎo)化合物，通過改變 4 位氨基上的取代基，合成了 38個吲唑衍生物，但改造效果并不令人滿意，只有幾個化合物與 LWQ-84 的活性相當或更好。其中，化合物 76 對 IDO1 和 TDO 的抑制作用最強，IC50分別為 0.74和 2.93 mol·L-1。且在 HeLa 細胞實驗中顯示 IDO1 抑制活性 (IC50 = 1.37 mol·L-1)，在 A172 細胞實驗中顯示 TDO 抑制活性 (IC50 = 7.54 mo

44、l·L-1)，在 CT26異種移植模型中表現(xiàn)出體內(nèi)抗腫瘤活性?？傮w來說，吲唑類化合物還需要進一步探索結(jié)構(gòu)優(yōu)化的位點。 4.3.3 其他母核結(jié)構(gòu) 近年，Kuang 課題組72,73對天然產(chǎn)物色胺酮的 2 位進行結(jié)構(gòu)修飾，合成了 24 個衍生物。大部分化合物都具有相似的 IDO1 和 TDO 抑制活性，在基于細胞的測定中均顯示出比酶活法測定更高的抑制活性，N-芐基取代的色胺醌 (77，圖 18，IDO IC50 = 0.5 mol·L-1；TDO IC50 = 0.76 mol·L-1) 活性要高于 N-苯基取代的色胺醌 (78，IDO IC50 = 2.2 mol·L-1；TDO IC50 = .59 mol·L-1)，化合物 79 對 IDO1 和 TDO 抑制活性最佳，IC50分別是 0.12 和 0.0