熒光定量pcr的實驗技巧

1、熒光定量PCR問題疑難解答（一）兩天我做標準曲線，線性關系還行，R平方0.998。但是擴增效率只有80%，另外擴增曲線也不是太光滑。2.我用SYBR作為熒光染料，樣品的熒光強度也挺低的，只有100-200左右。 A：曲線不光滑有時跟染料的量相關，可以加大看看，或者就是擴增產(chǎn)物太少了。1. PCR反應效率差：引物，試劑PCR條件的原因。做realtime-pcr優(yōu)化體系很重要，你的擴增效率低。可以增加Mg離子的濃度，如果其他條件都好了，還不行，那就是引物的原因，那你就只能重新設計引物了。2. PCR中混入影響反應的物質(zhì)：模板提取方法需要改進3. 樣品稀釋不準確：這很重要，做標準曲線很多不好的時候

2、，很多都是倍比稀釋的問題，正常情況10倍比稀釋時，前后是相差3.32個循環(huán)。Q：熒光定量PCR的靈敏度A：對于染料法的熒光定量來說，Ct值在1330之間比較準確，3033之間需要再次確認，在以上范圍內(nèi)的置信度比較差。Q：標準曲線要重復兩三次嗎?A：沒有人說做定量PCR標準曲線要重復兩三次，只是用來做標準曲線的梯度點最好不要少于4個，否則標準曲線準確性不高。Q：關于熒光定量標準曲線的制作A：一般的儀器雖然聲稱能進行單拷貝檢測，但如果不是特別設計的體系，很難做到100拷貝以下的準確定量，一般用來做標準曲線的最小濃度為1000拷貝，再往下可靠性就降低了，這不是稀釋或其他什么問題，而是本身你選作標準曲

3、線的濃度以及定量濃度最好不要低于1000拷貝，如果再低一點，100拷貝也勉強可以接受，否則即使你做出來，認可度也不會太高。Q：溶解曲線高矮A：Tm值相同，而峰高低有差異是表達豐度不同，同樣的擴增產(chǎn)物也會出現(xiàn)Tm值有微小差異，一般差異在1度以內(nèi)都可以接受。融解曲線的縱坐標表示熒光信號對溫度的一階負導數(shù)。Q：定量PCR沒有擴增A：把定量PCR的產(chǎn)物跑個電泳，看看有無產(chǎn)物，如果電泳有條帶，說明PCR是成功的，只是熒光信號沒有讀取到，這時要調(diào)整染料或探針的濃度（看你是染料法還是探針法）；如果電泳沒有條帶，那么還要在定量PCR儀上優(yōu)化實驗條件。雖然你在普通PCR儀上優(yōu)化過條件，但換了定量PCR儀，由于兩

4、臺儀器的升降溫速度及溫度精密度等指標存在差異，同樣的條件做不出PCR也是可能的。由于很多因素的影響，擴增子的溶解溫度會有一定變異。溶解溫度會受特殊緩沖液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2濃度和其他因素的影響。要做溶解曲線的對比你首先要確保所用的條件相同。Q：SG的穩(wěn)定性如何？ A：只要不進行稀釋，SG是非常穩(wěn)定的。一旦稀釋，可以保存1周到3個月，這取決于凍融次數(shù)，推薦配置成一定濃度的貯存液，用時現(xiàn)用現(xiàn)配稀釋液。為優(yōu)化SG反應，有必要在所有的常規(guī)步驟來確定，優(yōu)化擴增反應的條件（合適的MgCl2、dNTP和Taq酶濃度等）。結(jié)果應該在凝膠電泳上有唯一的條帶。SG分析的優(yōu)化主要包

5、括以下4個因素： a) SG 濃度 b) 引物濃度 c) MgCl2濃度 d) 溫度和反應次數(shù)推薦的SG終濃度變動范圍是1：5000到1：100000。經(jīng)常用到的濃度范圍是1：10000到1：70000。引物濃度的優(yōu)化應該測試不同濃度的正向和反向引物。引物濃度的范圍應該是50nM到300nM，然而，也有例外的情況。Q：熒光定量污染解決辦法A：幾個月前我也有跟你一樣的遭遇，當時跳樓的心都有。后來美國來人給培訓，按照他們的要求，污染果真就給控制了，兩個月來一直還很好。以下的經(jīng)驗希望對你有用。1. 配反應體系和加模板要在不同的屋子進行；2. 配體系的屋子準備一件干凈的白大衣，每次進去都要記

6、得換白大衣，至少要把別的屋子穿的白大衣脫掉；3. 分裝好體系以后把反應板/條放在一個有蓋的干凈的托盤中端到加樣的房間；4. 配體系戴的手套可以帶到加樣的房間，反過來不可；5. PCR完畢后，反應產(chǎn)物拿到別的屋子扔掉；6. 最重要的就是不要把DNA帶到配體系的屋子，以上幾點也都是為了這一目的。Q：熒光定量real-timePCR重復性問題A：建議不要只加1ul，而是稀釋10倍左右然后加10ul，這樣有助于改善重復性。如果你測的是拷貝數(shù)，重復性不好是很難避免的。我感覺用SYBR green作realtime的誤差還是比較大的，它的優(yōu)勢在于靈敏度高，但如果想精確定量，還是比較困難的，只好重復很多次，

7、或者多花錢買標記的引物，那個特異性最好。 Q：各位高手，今天第一次做完8個基因的相對熒光定量（ddct法），擴增時忘了做融解曲線了，現(xiàn)在是不是沒法再做融解曲線了？（ABI7500）對于每個基因都作了NTC對照，結(jié)果顯示NTC無擴增，這樣能否說明引物設計得還可以，沒有引物二聚體的產(chǎn)生？至于是否有非特異性產(chǎn)物，就必須得做融解曲線了？請幫忙指教一下啊A：把你的定量PCR產(chǎn)物重新作融解曲線，只是新建立一個反應，反應條件按照融解曲線的條件設定就可以了，沒必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲線單峰；ntc無CT值，融解曲線無峰，就不用電泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值減小3.32Cy

8、cles。Q：熒光閾值高，怎么改進？A：閾值取決于基線，基線是313cycles左右的熒光信號值標準偏差10倍，可能是背景高，把模板純化一下看看。要調(diào)整一下你的基線的起止循環(huán)數(shù)。一般開始的循環(huán)為2或3，中止循環(huán)為一次試驗最早起峰的Ct-3，即如果一條曲線在第13個循環(huán)就已經(jīng)起峰了，那么基線的中止循環(huán)可以設置為13-3=10。如果你的體系不存在問題，就可能是你的那次試驗模板濃度較高，起峰早，導致的閾值線過高。Q：熒光定量PCR檢測靈敏度和線性范圍的關系A：一般大家認為的檢測靈敏度即檢測下限，可以理解為能檢測到和準確定量的最低濃度(拷貝數(shù))，而線性范圍為能夠檢測的區(qū)間，即可以檢測及分辨的最低濃度到

9、最高濃度的數(shù)量級。但兩者都與熒光定量PCR儀器及試劑體系相關。Q：real time PCR CT值一般在多少后認為模板沒擴增？A：當進入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35個時，RealTime RT-PCR檢測無效，基因沒有表達；當進入對數(shù)的循環(huán)數(shù)在32-35個循環(huán)時，需要有至少3個重復才能判斷是否能檢測到基因的表達。Q：正常情況NTC是不應該出現(xiàn)CT值的嗎？A：如果是探針法，應該沒有Ct值，所謂的沒有，也是針對不同算法而言的。NTC一般沒有明顯的指數(shù)擴增，所以一般軟件不計算Ct。如果是染料法，可能在30個循環(huán)后有微弱起峰，并且軟件計算出Ct值，這時還要觀察溶解曲線，看擴增產(chǎn)物是否是引物二聚體。大多情況

10、是二聚體，這時也可以優(yōu)化條件，比如提高退火溫度等。如果是探針法，陰性對照起峰肯定是污染，如果是染料法，還要看溶解曲線：如果溶解曲線的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚體；如果溶解曲線是雙峰或更多峰，其中有與加模板后的擴增產(chǎn)物的Tm值相同的峰，那么就意味著存在污染。Q：real time PCR無結(jié)果，而用產(chǎn)物跑電泳條帶很清楚，什么問題？A：我也出現(xiàn)過此情況，后來發(fā)現(xiàn)是因為加樣的時間太長了，熒光染料暴露時間太長了，熒光基團淬滅了，出現(xiàn)上述問題還有一種情況，那就是熒光PCR儀的熒光采取信號值太低，有時也不穩(wěn)定。如果你使用探針法，有熒光信號而沒有求出Ct值，那么可能你的探針濃度有問題，可能太高

11、或者太低了，可能改變探針濃度看看。Q：最佳熒光采集溫度A：采集熒光的時機不是決定于溫度，而是決定于采用的方法。如果采用染料法，一般要在延伸階段的末點進行檢測，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法時大多在72度檢測。如果擴增產(chǎn)物中存在引物二聚體，也有采用更高的讀板溫度，比如76度、80度等，這時的讀板溫度與引物二聚體的Tm值相關。如果采用TaqMan探針法，由于TaqMan探針是累積熒光，理論上說在任何步驟檢測都可以，但目前TaqMan大多采用兩步法，所以在退火的末點進行檢測即可。如果采用分子信標的方法，就要在退火的末點進行檢測。如果采用FRET探針法，要在退火時進行熒光檢測。Q：標準曲線的討

12、論A：有一點可以告訴你：樣品濃度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀釋1000倍后再做。濃度高，很容易導致污染。而且第一二個梯度沒有分開啊。標準曲線的落點局限在15個循環(huán)以前，那樣你得到的反應有效線性范圍太窄，就是說要很高濃度的樣品才適用你這標準曲線。Q：定量PCR中，質(zhì)粒作為標準分子為何要線性化A：因為你要檢測的目的基因如果不出意外的話，應該是線性的吧，而你用來定標準曲線的目的基因確是連接在環(huán)狀的質(zhì)粒上的。我想單從變性和復性的難易上就會有很大的區(qū)別，當然會對引物的結(jié)合等各方面造成影響，何況環(huán)狀的空間構象和線性的空間構象上的差異了。做標準曲線時的基本原則之一就是要盡量的模仿需要定量

13、的基因所在的自然條件，所以說，如果做標準曲線時你可以有條件做到用和你要檢測的基因一樣的標準品做標準曲線的話，就不要選擇把一段基因克隆到質(zhì)粒上。但是一般情況下是很難做到的。樓上說的沒有酶切效果還行，那只是還行。熒光定量本來就是很容易受到很多因素影響的實驗，當然是要求嚴點好了，當然如果你檢測的基因本身就是環(huán)狀的，那當然不用線性化了，那樣反而不好了！線性化比較麻煩：首先要酶切，保證完全酶切，才能全部線性化。然后要回收，質(zhì)粒酶切后再回收容易被破壞，而且回收率也不是很高。第三，線性化的質(zhì)粒不容易保存，相對于環(huán)狀質(zhì)粒來說。所以，如果有實驗證據(jù)證明不線性化的質(zhì)?？梢杂?，那就可以省去很多事情了。Fig. 6

14、also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.線形化與環(huán)狀質(zhì)粒比較文章評論：這篇文章用這個質(zhì)粒對線性化和非線性化做了比較，從實驗結(jié)果看線性化并沒有對標準曲線產(chǎn)生任何改變。但是這篇文章只是擺出了試驗結(jié)果，并沒有從原理上分析這個實驗結(jié)果的原因，因此線性化對于標準曲線的作用并不能以這篇文章的結(jié)果來外推。就是說可能需要更多的實驗結(jié)果，或者從原理上分析了這篇文章的結(jié)果，才能得出結(jié)論來說明，線性化確實對

15、于所有,或大部分的質(zhì)粒標準分子是不必要的。熒光定量PCR問題疑難解答（二）Q：realtime pcr不同基因之間的閾值(threshold)是不是要一樣啊?A：如果做標準曲線或者相對定量，建議閾值還是一樣比較好。而且閾值一般要放置于擴增曲線的指數(shù)段，即熒光數(shù)據(jù)對數(shù)坐標軸下的線性段。如果擴增曲線的效率接近，閾值線的位置對于定量結(jié)果的影響是微乎其微的。Q：擴增曲線本底不斷升高是什么原因?A：我近期也遇到過這種現(xiàn)象，現(xiàn)在基本解決了，原因可能如下：1、試劑質(zhì)量差是主要原因，我用ABI的SYBR試劑做了一年從來沒有遇到過類似問題，而近期換成東洋紡的試劑就出現(xiàn)了這個問題，所以最好不要貪便宜用小鬼子的試劑

16、！2、模板不純是一個重要原因，我用東洋紡的試劑出現(xiàn)問題后，用ddH2O稀釋10倍以上（一定不要用TE稀釋，要不然可能會更差），問題基本解決；3、如果模板稀釋后基線還有一定的上升，結(jié)果分析時可以將基線從6以上設，避開初始的幾個上升厲害的循環(huán)；建議：要根本解決此問題請用質(zhì)量可靠的試劑，便宜沒好貨！Q：分子信標做的陰性對照，曲線為一條斜線，什么原因？A：和我以前做得沒消除背景的曲線挺相像。很可能是試劑的問題，我用東洋紡的試劑也得到過類似的曲線，換了試劑就好了！探針設計的問題！還有反應液體試劑酶離子調(diào)整。Q：標準曲線檢測限A：這是由于ABI儀器采用半導體加熱，其邊緣效應致使96孔加熱模塊的中央溫度高，

17、周邊溫度低。由于定量原理是通過已知濃度的標準品和未知樣本之間的比較來進行的，所以各孔位的反應參數(shù)可比性決定了定量的準確性。在模板濃度低的時候ABI的儀器各孔位熱循環(huán)不均導致的誤差經(jīng)過多個循環(huán)后被放大，最終影響定量結(jié)果的準確性。所以ABI儀器只能區(qū)分5000個拷貝和10000個拷貝的差異，而且必須用ABI的原裝試劑才能達到此效果，如果將模板再稀釋，就無法區(qū)分這2倍濃度差異了。你加入起始模板數(shù)分別是1000、100、10copy/ul 的反應孔，模板濃度太低了，ABI7000儀器不能檢測出來，建議用高濃度模板來做標準曲線。雖然現(xiàn)在的定量PCR儀好多都宣稱能做到單拷貝檢測，但這個前提是非?？量痰摹Ｐ?/p>

18、要模板、引物、體系、實驗條件設置一切都是最優(yōu)的情況下才可能做出來，而且一般還有比例。像一般低拷貝檢測Ct值不準確的情況還是很正常的，不需要郁悶的說，大家都是這樣。一般臨床檢測的下限不會低于100拷貝，所以你要考慮是不是真的要做低拷貝的檢測，另外，當Ct值大于30的時候結(jié)果就存在很大的不可信性，要反復確認，而低拷貝的Ct值一般都會大于30。Q：溶解曲線3個峰A：如果出現(xiàn)引物二聚體，可以從實驗條件和體系上加以優(yōu)化，比如提高退火溫度，降低引物濃度等。但如果非特異性的峰離目標產(chǎn)物的峰較近的話，那就需要重新設計引物了，從引物的設計上多做些考慮?？梢韵葍?yōu)化條件，如果沒有用的話就試試改變引物。引物二聚體的幾

19、個特征是溶解曲線的峰不明顯，即峰不尖且不高，另外是溶解溫度基本上低于80度。如果不符合上面的兩個條件，基本上就是體系污染了?？梢耘軅€電泳看看。樣本出現(xiàn)雙峰，也可以按照上面的判斷看看是否有引物二聚體還是非特異性擴增產(chǎn)物?？梢蕴岣?度退火溫度試試看，延長退火時間對于消除引物二聚體的作用不大。基本上采用染料法的確容易出現(xiàn)引物二聚體，尤其是30個循環(huán)之后。如果提高退火溫度后空白對照還是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。Q： A：你的實驗結(jié)果其實很好，是初始模板濃度設置錯了。1. 以2倍梯度稀釋的模板，Ct值的差異為1的時候擴增效率為100%，從標準曲線上來看，你的6個模板Ct差

20、異（標準曲線橫軸）還都在1以上一點，已經(jīng)很好；2. 你的模板是以2倍梯度稀釋的，這樣初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值每個濃度相差應該在0.3左右，從圖中看，標準曲線的縱軸每個梯度相差在0.7左右，似乎你設置時初始模板的拷貝數(shù)是按照5倍梯度設置的。你可以把Ct值取出來，根據(jù)初始模板自己做一個標準曲線看看，估計擴增效率可以達到90%以上。2倍梯度區(qū)分的很好！Q：只要Ct值大于30都是陰性嗎？一開始不用設定嗎？A：看你做什么檢測了，還要與對照品比對才能定性分析。不過，一般Ct值大于30結(jié)果置信度降低，需要多次確認。常規(guī)修飾基團分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.60 5-

21、(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.49 5-HEX 744.13 3-(6 FAM) 569.46 5-TET 675.24 3-Amino Modifier C3 153.07 5-Cy5 533.63 3-Amino Modifier C7 209.18 5-Cy3 507.59 3-Thiol Modifier C3 154.12熒光定量PCR問題疑難解答（三）Q：溶解曲線出現(xiàn)三個峰，以為是引物合成問題，重新合成三次引物，溶解曲線仍為三個峰。產(chǎn)物經(jīng)電泳證實卻為一條帶，為什么會出現(xiàn)這種結(jié)果？ A：我也曾經(jīng)出現(xiàn)過這個問題，但是我是

22、出現(xiàn)兩個峰，后來跑電泳證實是引物二聚體，<100bp的地方隱約出現(xiàn)一個引物二聚體的條帶，你跑電泳沒有其他條帶可能是電泳的靈敏度不夠吧，還有引物產(chǎn)生二聚體也不一定只產(chǎn)生一種結(jié)構的二聚體啊，可能會產(chǎn)生其他結(jié)構的二聚體啊，建議你可以繼續(xù)設計引物再試試，或者提高退火溫度看看！你的單一條帶是不是很寬啊？照圖上看來你的非特異性的產(chǎn)物和你的目的產(chǎn)物差不多大。非特異性擴增的條帶的Tm值和你的產(chǎn)物的還是有點接近。而且不一定是跑膠都能看到非特異性擴增的。我以前做完后跑膠都沒有目的條帶，但是擴增曲線還是不錯，但是熒光值都比較低。實時定量還是很敏感的。建議提高溫度，如果沒有目的條帶，就試著調(diào)一下鎂離子濃度。 Q

23、：最近作Real-time PCR有幾個問題請教：1. 產(chǎn)物可以進行電泳檢測嗎？2. 為什么陰性產(chǎn)物進行二次擴增也有較強的熒光信號（據(jù)Ct值可判為陽性）？且電泳似乎也有較亮的條帶，無法與陽性產(chǎn)物區(qū)別。3.在Ct值無法判斷陰性或陽性的情況下（接近或略高于判定陰性值時，有擴增曲線，但Ct值較大如37、38）如何下結(jié)論？ A：1. 熒光定量的結(jié)果可以進行電泳檢測。2. 如果陰性有擴增，說明PCR體系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很難消除。3. 結(jié)論根據(jù)原來定的標準下，比如原來設定ct>35為陰性，那當ct為36時就不要特意調(diào)整標準。確定其為陰性就可以了。4. 陽性產(chǎn)物做模板ct較低，其原

24、因是模板濃度較高，模板濃度的對數(shù)和ct成反比。所以，模板濃度越高，ct越低。 A：1. 產(chǎn)物是可以用來電泳的，不過由于定量PCR借助于熒光的作用靈敏度較高，電泳產(chǎn)物則一般條帶不會很亮；2. 產(chǎn)物的二次擴增在定量PCR中一般是不建議做的，原因很簡單，片段太短了，還是那個問題，定量PCR是高靈敏度的，再二次擴增很難排除二聚體、PCR污染、操作誤差等等因素，特別是污染，我們能排除的往往都只是你想到的，還有很多是一時想不到的；3. 如果你是用標準的檢測試劑盒，你只需要按說明書來就操作就可以，判斷結(jié)果同樣，如果你還想探究其中的陰性可能漏檢的問題，你應該用其他方法，而不能用這個試劑盒了。 Q：通過前輩的介

25、紹了解到：正常的ct值范圍在1830之間，ct值應是熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。如果正常情況下大于30應可以定為陰性。因為最近我也在用SYBR Green做實時定量PCR，所以也想向各位前輩請教一下有關Ct值的問題。我的結(jié)果中待測基因的Ct值大多在1825之間，但唯獨內(nèi)參照的Ct值很低。第一次做時基本都在10左右，將模板稀釋10倍后第二次的內(nèi)參照的Ct值還是在1214之間。以這樣的數(shù)據(jù)分析會影響結(jié)果的準確度嗎？或者還是將模板繼續(xù)稀釋，直到ct值都達到1830之間呢。 A：沒必要吧。一般ct超過30是不好，但要是三個重復都這樣，也還是可以用的啊，每次都做陰性對照陰性

26、對照ct為0，那ct30就肯定不是污染，而是基因表達量低或是模板太稀，內(nèi)參ct為1014都正常啊，沒必要再稀釋模板了，那樣你的目的基因ct又要超過30了，不過內(nèi)參ct太低，低于10也是不太好，結(jié)果可能會有偏差。 Q：real-time pcr結(jié)果可用來發(fā)文章的要求有哪些？ A：不用，但是在文章必須說明用電泳還是用溶解曲線檢測過。論文中把你的實驗方法說明白就可以了。簡單的一個表示圖，就可以發(fā)表了。不過REAL-TIME PCR 想用的話最好放溶解曲線圖，一般外文雜志喜歡接受。 Q：不知道為什么這兩天做熒光老不順，熒光Ct在20以下產(chǎn)物檢測很亮，而普通用mix酶跑PCR條帶卻很淡，難道是熒光定量的

27、酶比較好的原因嗎？另外我的NTC熒光在30多個循環(huán)的時候都有起峰，我用重開的一管新酶和新稀釋的引物以及新水做，還是有起峰，實在是搞不懂了。求大家?guī)蛶兔Π桑?A：1. 一些公司熒光定量試劑盒的酶是比普通Tag酶要好，主要是可以防止引物二聚體產(chǎn)生，引物二聚體少了，擴增效率自然高了。2. 也可能是你熒光定量的體系比你普通的PCR體系要優(yōu)化，比如有些公司熒光定量mix中的Mg離子濃度要高于普通的PCR體系。3. 可能是跑膠的問題?？纯茨愕腗ARKER還和以前一樣亮嗎？做熒光定量的短片段特別容易污染?？赡苁悄愕臉尡晃廴玖税?，是用的跑電泳的那把槍嗎？如果在35個循環(huán)后起峰，污染不算嚴重?？梢园褵晒舛縋C

28、R的基線調(diào)節(jié)到恰好高過陰性對照。 Q：請問下現(xiàn)在的PCR熒光診斷試劑盒里面，國家規(guī)定都要求要有臨界陽對照嗎？這些對照品是不是一定要和樣本一起提取呢？還有臨界陽用陽性對照來稀釋來得到可以嗎？不知道要怎么稀釋比較好呢？ A：陽性對照和陰性對照必須要和樣品一起提取，進行平行實驗，這樣才有作為對照的意義。臨界陽性樣品是不能通過陽性對照稀釋的，除非你知道臨界陽性的濃度，經(jīng)過定量標定將陽性對照稀釋到臨界陽性。 Q：本人檢測的目的基因共有5個處理，每個處理做兩次重復，現(xiàn)在的問題每個處理內(nèi)重復性非常差，有的Ct值差異達到了10，不知道是怎么回事？ A：換了一個退火溫度把所有的設計好的引物都拿來重新試了一下，現(xiàn)

29、在有一對引物兩個溫度都還好?；旧夏軌蜻_到要求了。另外，我使用的是BIO-RAD的儀器，感覺邊上跟中間溫度差異挺大的，因為之前這對引物我也曾經(jīng)試過的，但是放在邊上一個，結(jié)果差異很大。經(jīng)驗教訓??！ Q：熒光量開始很高 A：根據(jù)TAKARA的資料說，這是因為摸板濃度過大了，把它再稀釋，然后再做看看。是模板濃度過大引起的，可以看到曲線圖中最高濃度的樣品的Ct值很小。但是這張圖也能用的，你調(diào)整一下基線范圍，把背景熒光壓下去，這樣以來圖就漂亮了就能分析了。 Q：剛做了一次real time PCR，結(jié)果解離曲線中出現(xiàn)了負值 A：這個曲線反應的是隨著溫度的變化熒光值的變化速率。值越高，則此時PCR產(chǎn)物熒光

30、值變化越快，也就是說PCR產(chǎn)物變性速度最快。當溫度達到Tm值時，PCR產(chǎn)物迅速變性，熒光值急劇下降，表現(xiàn)在這張圖上就是出現(xiàn)一個峰。產(chǎn)物越純，峰越窄，PCR產(chǎn)物越多，峰越高。這樣看來，出現(xiàn)負值表明此溫度下PCR產(chǎn)物變性速度沒有兩邊的溫度是快。70-80度時，已經(jīng)出現(xiàn)變性，但是較為緩慢。但是你的產(chǎn)物看來不是特別純，峰比較寬，可能要改變反映條件或者改變引物。熒光定量PCR問題疑難解答（一）兩天我做標準曲線，線性關系還行，R平方0.998。但是擴增效率只有80%，另外擴增曲線也不是太光滑。2.我用SYBR作為熒光染料，樣品的熒光強度也挺低的，只有100-200左右。 A：曲線不光滑有時跟染料的量相關，

31、可以加大看看，或者就是擴增產(chǎn)物太少了。1. PCR反應效率差：引物，試劑PCR條件的原因。做realtime-pcr優(yōu)化體系很重要，你的擴增效率低?？梢栽黾覯g離子的濃度，如果其他條件都好了，還不行，那就是引物的原因，那你就只能重新設計引物了。2. PCR中混入影響反應的物質(zhì)：模板提取方法需要改進3. 樣品稀釋不準確：這很重要，做標準曲線很多不好的時候，很多都是倍比稀釋的問題，正常情況10倍比稀釋時，前后是相差3.32個循環(huán)。Q：熒光定量PCR的靈敏度A：對于染料法的熒光定量來說，Ct值在1330之間比較準確，3033之間需要再次確認，在以上范圍內(nèi)的置信度比較差。Q：標準曲線要重復兩三次嗎?A

32、：沒有人說做定量PCR標準曲線要重復兩三次，只是用來做標準曲線的梯度點最好不要少于4個，否則標準曲線準確性不高。Q：關于熒光定量標準曲線的制作A：一般的儀器雖然聲稱能進行單拷貝檢測，但如果不是特別設計的體系，很難做到100拷貝以下的準確定量，一般用來做標準曲線的最小濃度為1000拷貝，再往下可靠性就降低了，這不是稀釋或其他什么問題，而是本身你選作標準曲線的濃度以及定量濃度最好不要低于1000拷貝，如果再低一點，100拷貝也勉強可以接受，否則即使你做出來，認可度也不會太高。Q：溶解曲線高矮A：Tm值相同，而峰高低有差異是表達豐度不同，同樣的擴增產(chǎn)物也會出現(xiàn)Tm值有微小差異，一般差異在1度以內(nèi)都可

33、以接受。融解曲線的縱坐標表示熒光信號對溫度的一階負導數(shù)。Q：定量PCR沒有擴增A：把定量PCR的產(chǎn)物跑個電泳，看看有無產(chǎn)物，如果電泳有條帶，說明PCR是成功的，只是熒光信號沒有讀取到，這時要調(diào)整染料或探針的濃度（看你是染料法還是探針法）；如果電泳沒有條帶，那么還要在定量PCR儀上優(yōu)化實驗條件。雖然你在普通PCR儀上優(yōu)化過條件，但換了定量PCR儀，由于兩臺儀器的升降溫速度及溫度精密度等指標存在差異，同樣的條件做不出PCR也是可能的。由于很多因素的影響，擴增子的溶解溫度會有一定變異。溶解溫度會受特殊緩沖液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2濃度和其他因素的影響。要做溶解曲線的對比你首先要確

34、保所用的條件相同。Q：SG的穩(wěn)定性如何？ A：只要不進行稀釋，SG是非常穩(wěn)定的。一旦稀釋，可以保存1周到3個月，這取決于凍融次數(shù)，推薦配置成一定濃度的貯存液，用時現(xiàn)用現(xiàn)配稀釋液。為優(yōu)化SG反應，有必要在所有的常規(guī)步驟來確定，優(yōu)化擴增反應的條件（合適的MgCl2、dNTP和Taq酶濃度等）。結(jié)果應該在凝膠電泳上有唯一的條帶。SG分析的優(yōu)化主要包括以下4個因素： a) SG 濃度 b) 引物濃度 c) MgCl2濃度 d) 溫度和反應次數(shù)推薦的SG終濃度變動范圍是1：5000到1：100000。經(jīng)常用到的濃度范圍是1：10000到1：70000。引物濃度的優(yōu)化應該測試不同濃度的

35、正向和反向引物。引物濃度的范圍應該是50nM到300nM，然而，也有例外的情況。Q：熒光定量污染解決辦法A：幾個月前我也有跟你一樣的遭遇，當時跳樓的心都有。后來美國來人給培訓，按照他們的要求，污染果真就給控制了，兩個月來一直還很好。以下的經(jīng)驗希望對你有用。1. 配反應體系和加模板要在不同的屋子進行；2. 配體系的屋子準備一件干凈的白大衣，每次進去都要記得換白大衣，至少要把別的屋子穿的白大衣脫掉；3. 分裝好體系以后把反應板/條放在一個有蓋的干凈的托盤中端到加樣的房間；4. 配體系戴的手套可以帶到加樣的房間，反過來不可；5. PCR完畢后，反應產(chǎn)物拿到別的屋子扔掉；6. 最重要的就是不要把DNA

36、帶到配體系的屋子，以上幾點也都是為了這一目的。Q：熒光定量real-timePCR重復性問題A：建議不要只加1ul，而是稀釋10倍左右然后加10ul，這樣有助于改善重復性。如果你測的是拷貝數(shù)，重復性不好是很難避免的。我感覺用SYBR green作realtime的誤差還是比較大的，它的優(yōu)勢在于靈敏度高，但如果想精確定量，還是比較困難的，只好重復很多次，或者多花錢買標記的引物，那個特異性最好。 Q：各位高手，今天第一次做完8個基因的相對熒光定量（ddct法），擴增時忘了做融解曲線了，現(xiàn)在是不是沒法再做融解曲線了？（ABI7500）對于每個基因都作了NTC對照，結(jié)果顯示NTC無擴增，這樣

37、能否說明引物設計得還可以，沒有引物二聚體的產(chǎn)生？至于是否有非特異性產(chǎn)物，就必須得做融解曲線了？請幫忙指教一下啊A：把你的定量PCR產(chǎn)物重新作融解曲線，只是新建立一個反應，反應條件按照融解曲線的條件設定就可以了，沒必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲線單峰；ntc無CT值，融解曲線無峰，就不用電泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值減小3.32Cycles。Q：熒光閾值高，怎么改進？A：閾值取決于基線，基線是313cycles左右的熒光信號值標準偏差10倍，可能是背景高，把模板純化一下看看。要調(diào)整一下你的基線的起止循環(huán)數(shù)。一般開始的循環(huán)為2或3，中止循環(huán)為一次試驗最早起峰的Ct-3，即如果

38、一條曲線在第13個循環(huán)就已經(jīng)起峰了，那么基線的中止循環(huán)可以設置為13-3=10。如果你的體系不存在問題，就可能是你的那次試驗模板濃度較高，起峰早，導致的閾值線過高。Q：熒光定量PCR檢測靈敏度和線性范圍的關系A：一般大家認為的檢測靈敏度即檢測下限，可以理解為能檢測到和準確定量的最低濃度(拷貝數(shù))，而線性范圍為能夠檢測的區(qū)間，即可以檢測及分辨的最低濃度到最高濃度的數(shù)量級。但兩者都與熒光定量PCR儀器及試劑體系相關。Q：real time PCR CT值一般在多少后認為模板沒擴增？A：當進入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35個時，RealTime RT-PCR檢測無效，基因沒有表達；當進入對數(shù)的循環(huán)數(shù)在32-

39、35個循環(huán)時，需要有至少3個重復才能判斷是否能檢測到基因的表達。Q：正常情況NTC是不應該出現(xiàn)CT值的嗎？A：如果是探針法，應該沒有Ct值，所謂的沒有，也是針對不同算法而言的。NTC一般沒有明顯的指數(shù)擴增，所以一般軟件不計算Ct。如果是染料法，可能在30個循環(huán)后有微弱起峰，并且軟件計算出Ct值，這時還要觀察溶解曲線，看擴增產(chǎn)物是否是引物二聚體。大多情況是二聚體，這時也可以優(yōu)化條件，比如提高退火溫度等。如果是探針法，陰性對照起峰肯定是污染，如果是染料法，還要看溶解曲線：如果溶解曲線的Tm值在80度以下，那么很可能是引物二聚體；如果溶解曲線是雙峰或更多峰，其中有與加模板后的擴增產(chǎn)物的Tm值相同的峰

40、，那么就意味著存在污染。Q：real time PCR無結(jié)果，而用產(chǎn)物跑電泳條帶很清楚，什么問題？A：我也出現(xiàn)過此情況，后來發(fā)現(xiàn)是因為加樣的時間太長了，熒光染料暴露時間太長了，熒光基團淬滅了，出現(xiàn)上述問題還有一種情況，那就是熒光PCR儀的熒光采取信號值太低，有時也不穩(wěn)定。如果你使用探針法，有熒光信號而沒有求出Ct值，那么可能你的探針濃度有問題，可能太高或者太低了，可能改變探針濃度看看。Q：最佳熒光采集溫度A：采集熒光的時機不是決定于溫度，而是決定于采用的方法。如果采用染料法，一般要在延伸階段的末點進行檢測，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法時大多在72度檢測。如果擴增產(chǎn)物中存在引物二聚體，

41、也有采用更高的讀板溫度，比如76度、80度等，這時的讀板溫度與引物二聚體的Tm值相關。如果采用TaqMan探針法，由于TaqMan探針是累積熒光，理論上說在任何步驟檢測都可以，但目前TaqMan大多采用兩步法，所以在退火的末點進行檢測即可。如果采用分子信標的方法，就要在退火的末點進行檢測。如果采用FRET探針法，要在退火時進行熒光檢測。Q：標準曲線的討論A：有一點可以告訴你：樣品濃度太高，beta-actin都是很高的，要漂亮就稀釋1000倍后再做。濃度高，很容易導致污染。而且第一二個梯度沒有分開啊。標準曲線的落點局限在15個循環(huán)以前，那樣你得到的反應有效線性范圍太窄，就是說要很高濃度的樣品才

42、適用你這標準曲線。Q：定量PCR中，質(zhì)粒作為標準分子為何要線性化A：因為你要檢測的目的基因如果不出意外的話，應該是線性的吧，而你用來定標準曲線的目的基因確是連接在環(huán)狀的質(zhì)粒上的。我想單從變性和復性的難易上就會有很大的區(qū)別，當然會對引物的結(jié)合等各方面造成影響，何況環(huán)狀的空間構象和線性的空間構象上的差異了。做標準曲線時的基本原則之一就是要盡量的模仿需要定量的基因所在的自然條件，所以說，如果做標準曲線時你可以有條件做到用和你要檢測的基因一樣的標準品做標準曲線的話，就不要選擇把一段基因克隆到質(zhì)粒上。但是一般情況下是很難做到的。樓上說的沒有酶切效果還行，那只是還行。熒光定量本來就是很容易受到很多因素影響

43、的實驗，當然是要求嚴點好了，當然如果你檢測的基因本身就是環(huán)狀的，那當然不用線性化了，那樣反而不好了！線性化比較麻煩：首先要酶切，保證完全酶切，才能全部線性化。然后要回收，質(zhì)粒酶切后再回收容易被破壞，而且回收率也不是很高。第三，線性化的質(zhì)粒不容易保存，相對于環(huán)狀質(zhì)粒來說。所以，如果有實驗證據(jù)證明不線性化的質(zhì)?？梢杂?，那就可以省去很多事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid D

44、NA.線形化與環(huán)狀質(zhì)粒比較文章評論：這篇文章用這個質(zhì)粒對線性化和非線性化做了比較，從實驗結(jié)果看線性化并沒有對標準曲線產(chǎn)生任何改變。但是這篇文章只是擺出了試驗結(jié)果，并沒有從原理上分析這個實驗結(jié)果的原因，因此線性化對于標準曲線的作用并不能以這篇文章的結(jié)果來外推。就是說可能需要更多的實驗結(jié)果，或者從原理上分析了這篇文章的結(jié)果，才能得出結(jié)論來說明，線性化確實對于所有,或大部分的質(zhì)粒標準分子是不必要的。熒光定量PCR問題疑難解答（二）Q：realtime pcr不同基因之間的閾值(threshold)是不是要一樣啊?A：如果做標準曲線或者相對定量，建議閾值還是一樣比較好。而且閾值一般要放置于擴增曲線的指

45、數(shù)段，即熒光數(shù)據(jù)對數(shù)坐標軸下的線性段。如果擴增曲線的效率接近，閾值線的位置對于定量結(jié)果的影響是微乎其微的。Q：擴增曲線本底不斷升高是什么原因?A：我近期也遇到過這種現(xiàn)象，現(xiàn)在基本解決了，原因可能如下：1、試劑質(zhì)量差是主要原因，我用ABI的SYBR試劑做了一年從來沒有遇到過類似問題，而近期換成東洋紡的試劑就出現(xiàn)了這個問題，所以最好不要貪便宜用小鬼子的試劑！2、模板不純是一個重要原因，我用東洋紡的試劑出現(xiàn)問題后，用ddH2O稀釋10倍以上（一定不要用TE稀釋，要不然可能會更差），問題基本解決；3、如果模板稀釋后基線還有一定的上升，結(jié)果分析時可以將基線從6以上設，避開初始的幾個上升厲害的循環(huán)；建議：

46、要根本解決此問題請用質(zhì)量可靠的試劑，便宜沒好貨！Q：分子信標做的陰性對照，曲線為一條斜線，什么原因？A：和我以前做得沒消除背景的曲線挺相像。很可能是試劑的問題，我用東洋紡的試劑也得到過類似的曲線，換了試劑就好了！探針設計的問題！還有反應液體試劑酶離子調(diào)整。Q：標準曲線檢測限A：這是由于ABI儀器采用半導體加熱，其邊緣效應致使96孔加熱模塊的中央溫度高，周邊溫度低。由于定量原理是通過已知濃度的標準品和未知樣本之間的比較來進行的，所以各孔位的反應參數(shù)可比性決定了定量的準確性。在模板濃度低的時候ABI的儀器各孔位熱循環(huán)不均導致的誤差經(jīng)過多個循環(huán)后被放大，最終影響定量結(jié)果的準確性。所以ABI儀器只能區(qū)

47、分5000個拷貝和10000個拷貝的差異，而且必須用ABI的原裝試劑才能達到此效果，如果將模板再稀釋，就無法區(qū)分這2倍濃度差異了。你加入起始模板數(shù)分別是1000、100、10copy/ul 的反應孔，模板濃度太低了，ABI7000儀器不能檢測出來，建議用高濃度模板來做標準曲線。雖然現(xiàn)在的定量PCR儀好多都宣稱能做到單拷貝檢測，但這個前提是非常苛刻的。需要模板、引物、體系、實驗條件設置一切都是最優(yōu)的情況下才可能做出來，而且一般還有比例。像一般低拷貝檢測Ct值不準確的情況還是很正常的，不需要郁悶的說，大家都是這樣。一般臨床檢測的下限不會低于100拷貝，所以你要考慮是不是真的要做低拷貝的檢測，另外，

48、當Ct值大于30的時候結(jié)果就存在很大的不可信性，要反復確認，而低拷貝的Ct值一般都會大于30。Q：溶解曲線3個峰A：如果出現(xiàn)引物二聚體，可以從實驗條件和體系上加以優(yōu)化，比如提高退火溫度，降低引物濃度等。但如果非特異性的峰離目標產(chǎn)物的峰較近的話，那就需要重新設計引物了，從引物的設計上多做些考慮?？梢韵葍?yōu)化條件，如果沒有用的話就試試改變引物。引物二聚體的幾個特征是溶解曲線的峰不明顯，即峰不尖且不高，另外是溶解溫度基本上低于80度。如果不符合上面的兩個條件，基本上就是體系污染了?？梢耘軅€電泳看看。樣本出現(xiàn)雙峰，也可以按照上面的判斷看看是否有引物二聚體還是非特異性擴增產(chǎn)物?？梢蕴岣?度退火溫度試試看，

49、延長退火時間對于消除引物二聚體的作用不大?；旧喜捎萌玖戏ǖ拇_容易出現(xiàn)引物二聚體，尤其是30個循環(huán)之后。如果提高退火溫度后空白對照還是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。Q： A：你的實驗結(jié)果其實很好，是初始模板濃度設置錯了。1. 以2倍梯度稀釋的模板，Ct值的差異為1的時候擴增效率為100%，從標準曲線上來看，你的6個模板Ct差異（標準曲線橫軸）還都在1以上一點，已經(jīng)很好；2. 你的模板是以2倍梯度稀釋的，這樣初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值每個濃度相差應該在0.3左右，從圖中看，標準曲線的縱軸每個梯度相差在0.7左右，似乎你設置時初始模板的拷貝數(shù)是按照5倍梯度設置的。你可以把C

50、t值取出來，根據(jù)初始模板自己做一個標準曲線看看，估計擴增效率可以達到90%以上。2倍梯度區(qū)分的很好！Q：只要Ct值大于30都是陰性嗎？一開始不用設定嗎？A：看你做什么檢測了，還要與對照品比對才能定性分析。不過，一般Ct值大于30結(jié)果置信度降低，需要多次確認。常規(guī)修飾基團分子量5-Biotin 405.45 3-TAMARA 623.60 5-(6 FAM) 537.46 3-Dabsyl 498.49 5-HEX 744.13 3-(6 FAM) 569.46 5-TET 675.24 3-Amino Modifier C3 153.07 5-Cy5 5

51、33.63 3-Amino Modifier C7 209.18 5-Cy3 507.59 3-Thiol Modifier C3 154.12熒光定量PCR問題疑難解答（三）Q：溶解曲線出現(xiàn)三個峰，以為是引物合成問題，重新合成三次引物，溶解曲線仍為三個峰。產(chǎn)物經(jīng)電泳證實卻為一條帶，為什么會出現(xiàn)這種結(jié)果？ A：我也曾經(jīng)出現(xiàn)過這個問題，但是我是出現(xiàn)兩個峰，后來跑電泳證實是引物二聚體，<100bp的地方隱約出現(xiàn)一個引物二聚體的條帶，你跑電泳沒有其他條帶可能是電泳的靈敏度不夠吧，還有引物產(chǎn)生二聚體也不一定只產(chǎn)生一種結(jié)構的二聚體啊，可能會產(chǎn)生其他結(jié)構的二聚體啊，建議你可以繼續(xù)設計引物再

52、試試，或者提高退火溫度看看！你的單一條帶是不是很寬啊？照圖上看來你的非特異性的產(chǎn)物和你的目的產(chǎn)物差不多大。非特異性擴增的條帶的Tm值和你的產(chǎn)物的還是有點接近。而且不一定是跑膠都能看到非特異性擴增的。我以前做完后跑膠都沒有目的條帶，但是擴增曲線還是不錯，但是熒光值都比較低。實時定量還是很敏感的。建議提高溫度，如果沒有目的條帶，就試著調(diào)一下鎂離子濃度。 Q：最近作Real-time PCR有幾個問題請教：1. 產(chǎn)物可以進行電泳檢測嗎？2. 為什么陰性產(chǎn)物進行二次擴增也有較強的熒光信號（據(jù)Ct值可判為陽性）？且電泳似乎也有較亮的條帶，無法與陽性產(chǎn)物區(qū)別。3.在Ct值無法判斷陰性或陽性的情況下（接近或

53、略高于判定陰性值時，有擴增曲線，但Ct值較大如37、38）如何下結(jié)論？ A：1. 熒光定量的結(jié)果可以進行電泳檢測。2. 如果陰性有擴增，說明PCR體系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很難消除。3. 結(jié)論根據(jù)原來定的標準下，比如原來設定ct>35為陰性，那當ct為36時就不要特意調(diào)整標準。確定其為陰性就可以了。4. 陽性產(chǎn)物做模板ct較低，其原因是模板濃度較高，模板濃度的對數(shù)和ct成反比。所以，模板濃度越高，ct越低。 A：1. 產(chǎn)物是可以用來電泳的，不過由于定量PCR借助于熒光的作用靈敏度較高，電泳產(chǎn)物則一般條帶不會很亮；2. 產(chǎn)物的二次擴增在定量PCR中一般是不建議做的，原因很簡單，片段太短了，還是那個問題，定量PCR是高靈敏度的，再二次擴增很難排除二聚體、PCR污染、操作誤差等等因素，特別是污染，我們能排除的往往都只是你想到的，還有很