多肽固相合成

1、發(fā)明英文解釋：solid phase peptide synthesis簡寫為SPPS在肽合成的技術方面取得了突破性進展的是R.Bruce Merrifield,他設計了一種肽的合成途徑并定名為固相合成途徑。由丁R.BruceMerrifield在 肽合成方面的貢獻，1984年獲得了諾貝爾獎。下面給出了肽固相合成途徑 的簡單過程（合成一個二肽的過程）。氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團（圖中的X）保護的氨基酸共價連接在固相載體上。在三氟乙酸的作 用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了。然 后氨基被封閉的第二個氨基酸的埃基通過N,N,-二環(huán)己基

2、碳二業(yè)胺（DCC,Dicyclohexylcarbodiimide ）活化，埃基被DCC活化的第二個氨基酸再與已 接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就 生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護基X,用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。固相合成的優(yōu)點主要表現在最初的反應物和產物都是連接在固相載體 上，因此可以在一個反應容器中進行所有的反應，便丁自動化操作，加入 過量的反應物可以獲得高產率的產物，同時產物很容易分離。化學合成多肽現在可以在程序控制的自動化多肽合成儀上進行。Merr

3、ifield成功地合成出了舒緩激肽（9肽）和具有124個氨基酸殘基的核 糖核酸酶。1965年9月，中國科學家在世界上首次人工合成了牛胰島素。固相合成法的誕生多肽合成研究已經走過了一白多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由丁當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相 當緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用節(jié)氧球基（Z）來保護氐氨基，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀50年代，有機化學家們合成了大量的生物活性多肽，包 括催產素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得 了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現提供了實驗和

4、理論基礎。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS),這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出現就由丁其合成方便，迅速，成 為多肽合成的首選方法，而且?guī)砹硕嚯挠袡C合成上的一次革命，并成為 了一支獨立的學科 一一固相有機合成(SPOS)。因此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學獎。Merrifield經過了反復的篩選，最終屏棄了節(jié)氧球基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧球基(BOC)用丁保護a-氨基并在固相多肽合 成上使用，同時，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺多肽合成儀，并首次 合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個氨基酸)。1972

5、年，Lou Carpin。首先將9-協(xié)甲氧球基(FMOC)用丁保護a-氨基， 其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全， 而且由丁其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時，固相 合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護基，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交 保護上也取得了豐碩的成果。多肽合成儀的介紹多肽合成儀的誕生雖然Merrifield在發(fā)明固相多肽合成科學并取得巨大成功的同時，使用了自主研發(fā)的合成設備，但卻沒因此將多肽合成儀引入市場。1970年，Beckman公司開發(fā)的全自動多肽合成儀Beckman

6、 990 Peptide Synthesizer作為第一臺投入市場的科研用多肽合成儀，被美國多所大學的實驗室采用。幾乎同一時間,Vega Biotechnologies, Inc.公司開發(fā)出兩款經濟型多肽合成儀：Vega s Coupler 1000與Vega s Coupler 250(不久乂推出Vega s Coupler296),其將多肽合成后續(xù)的在線切割理念結合到設備中， 所有反應器 采用防爆玻璃材質，防止TFA的腐蝕。被當時的肽化學界稱為最經濟適用 的多肽合成儀。而今，Beckman與Vega s兩家公司均停止的多肽合成儀的研發(fā)與制造， 而轉向到更多面的化學合成、分離、檢測技術設備的

7、研制產業(yè)中。多肽合成儀的發(fā)展第一代多肽合成儀是以Beckman公司推出的Beckman 990 PeptideSynthesizer以及Vega sBiotechnologies公司推出的Vega s296 Peptide Synthesizer為代表的，誕生在上世紀七十年代。雖然隨著生產工藝的改進和發(fā)展，如今第一代多肽合成儀已全部退出 了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發(fā)而 來，第一代的多肽合成儀為之后的合成儀研發(fā)與制造產生了重大意義。第二代多肽合成儀是以Protein Technologies公司推出的PS3 PeptideSynthesizer以及Advan

8、ced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90為代表的，誕生在上世紀八十年代。此兩款設備也是目前市場上 仍在銷售的最早的多肽合成儀。PS3的設計原理是采用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即 合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出， 在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構 簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會抱團”，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除后要把壓力立刻調低，不然的話較高的壓 力會把多肽-固相載體

9、 吹”到反應器液面上方。由丁多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參 加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的，這就是造成反 應 死角”的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發(fā)，液面降低后一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周 運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉動角度與速度都 不能夠完全達到氨基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。第三代多肽合

10、成儀是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptidesynthesizer與C S Bio公司的CS336為代表的無死角多肽合成儀為代表的， 誕生在上世紀九十年代。ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器 的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內部的任意點，真正做到了無 死角。由丁攪拌速率可達每分鐘1800轉的高速，反應得以充分完全。由丁無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場后最后一款儀器）至今在世界上還占有著很大的比例。當然,AB

11、I產品的售價也是最高的。由丁部件使用頻率高，電磁閥會經常損壞， 而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個 模塊，無形中增加了維修成本。CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉攪拌，攪拌速度可達180rpm,同時其采用了氮氣鼓泡反應方式的優(yōu)越性，將氮氣吹 動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領域的高耦合率 效果得到充分體現。多肽合成儀的現狀進入二十世紀以來，各大合成儀制造公司相繼推出了升級產品和新產品，如Protein Technologies公司推出Tribute雙通道多肽合成儀，將 短信 通知”功能融入產品，增添了用戶與設備之間的緊密

12、感，更加人性化；C S Bio公司對其從研發(fā)型到生產型設備的UV Online Monitor系統(tǒng)配置統(tǒng)一升級，用戶可直觀看到每一部氨基酸偶聯反應的狀態(tài)并可根據數據調整出最佳合 成效果與工藝；Advanced ChemTech公司自2005年破產重組后分裂為兩家 新公司，其中Aapptec延續(xù)了其前身的生產步驟，推出Focus XC三通道合 成儀。美國另一家公司CEM以蛋白質有機反應設備的制造著稱，推出了微波多肽合成儀同樣可以合成簡單的小分子多肽。其采用微波加熱方式，大大提高了反應速度，將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾 倍?？上У氖窃诩訜岬那闆r下副反應也相應增多，多肽純度不能與之

13、前的 第三代甚至第二代產品媲美。另外，微波加熱方法無法放大，故不適合用作多肽藥物的研發(fā)活化基團Fmoc與tBoc多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（埃基端）向N端（氨基端）合成。固相合成法，大大的減輕了每步產品提純 的難度。為了防止副反應的發(fā)生，參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。?；耸怯坞x的，并且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種， 即Fmoc和tBoc。由丁Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現在大多采用Fmoc法合成具體合成由下列幾個循環(huán)組成：1.去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine） 去除氨基的保護基團。2.激活和交聯：下一個

14、氨基酸的埃基被一種活化劑所活化?；罨膯?體與游離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅 使反應完成。循環(huán)：這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。3.洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護。樹脂的選擇及氨基酸的固定將固相合成與其他技術分開來的最主要的特征是固相載體，能用丁多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應位點 （或反應基團），以使肽鏈連在這些位點上，并在以后除去；必須對合成過程中的物理和化 學條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻 礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載 體給

15、出有用產量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作 用。用丁固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導入反應基團，才能直接連上（第一個）氨基酸。根據所導入反應基團的不同， 乂把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、?；鶚渲被鶚渲蝓Ｔ虏⑿蜆渲?。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，如Merrifield樹脂；FMOC合 成法通常選擇?；鶚渲缤跏蠘渲０被岬墓潭ㄖ饕峭ㄟ^保護氨基酸的?；瑯渲姆磻鶊F之間形成的共價鍵來實現的，形成共價鍵的方法 有多種：氯甲基樹脂，通常先制得保護氨基酸的四甲鉉鹽或鈉鹽、鉀鹽

16、、 飩鹽，然后在適當溫度下，直接同樹脂反應或在合適的有機溶劑如二氧六 環(huán)、DMF或DMSO中反應；埃基樹脂，則通常加入適當的縮合劑如DCC或埃基二咪口坐，使被保護氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨 基樹脂或酰月井型樹脂，卻是加入適當的縮合劑如DCC后，通過保護氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。氨基、蔑基、側鏈的保護及脫除要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺 鍵的氨基和?；右员Ｗo，同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護，反 應完成后再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧球 基類型作為a氨基的保護基，因為這樣不易發(fā)生消旋。最早是用節(jié)氧球

17、基，由丁它需要較強的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧球基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的 肽類的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc（9-協(xié)甲氧球基）作為a氨基保護基，Fmoc基對酸很穩(wěn)定，但能用哌噬-CH2CL2或哌噬-DMF脫去，近年來，Fmoc合成法得到了廣泛的應用。?；ǔＳ?形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護?；某Ｓ梅椒ǎ?可通過皂化除去或轉變?yōu)樵戮员阌枚∑瑪嘟M合；叔丁酯在酸性條件下除去； 節(jié)酯常用催化氫化除去。對丁合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側 鏈功能基

18、的氨基酸的肽來說， 為了避免由丁側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要 保證側鏈基團不參與形成酰胺的反應，乂要保證在肽合成過程中不受破壞， 同時乂要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-,用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪哇環(huán)用2,2,2-三氟-1-節(jié)氧球基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧球基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。 精氨酸用金剛烷氧球基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保 護的及?；槐Ｗo的氨基酸放在溶液內并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經常用的

19、手段是將?；罨兂苫旌纤狒?、活潑酯、酰氯或用強的失去劑 （如碳二業(yè)氨）形成對稱酸酎等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酎法、活化酯法接肽應用最廣。裂解及合成肽鏈的純化BOC法用TFA+HF裂解和脫側鏈保護基，FMOC法直接用TFA,有時根據條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解 等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用高 效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。HPLC分析和純化分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細 的微粒（3-10H m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。HPLC分兩類：離子交換和反相。離子

20、交換HPLC依靠多肽和固相問的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH ,離子強度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽從柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用 降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上 的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。由丁洗脫是一種疏水

21、作用。 大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。然而，總體實踐中，這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成，比如苯基。典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile0.1%TFA-H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6 250mm（3- 10 H m）和22X 250mm（10卜m）.如果用徑向填柱，那么大小是8X100 （3-10叩）和25 x 250mm（10卜m）。大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric 酸，0.1%磷 酸，稀Heformic酸（5

22、-6%, pH2-4）, 10-100mM NH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA,磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要 注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露丁高pH,甚至微堿pH,因為這樣會破壞柱子。Fmob氨基酸的制備和側鏈保護Fmoc基團是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六環(huán)溶液中，理想的Fmoc-氨基酸的側鏈保護基應在堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下脫除側鏈保護1.1. AspAsp和GluGluAsp和Glu側鏈?；Ｓ胻-Bu保護.可用TFA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護仍有側鏈環(huán)化形成酰業(yè)胺的副反應發(fā)生.近年來，發(fā)展了一些新的保護基如環(huán)烷醇酯、金剛

23、烷醇酯等可減輕這一副反應，這些保護基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.2.2. SerSer、ThrThr和TyrTyrser、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護.叔丁基的引入比較麻 煩，首先ser制成節(jié)氧球基酯，再在酸催化下與異丁烯反應.Ser和Thr還可用節(jié)基保護，Ser用節(jié)醇引入節(jié)基、Thr用漠節(jié)引入節(jié)基.3.3. AsnAsn和GlnGlnAsn和Gln側鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護.但合成大肽時，Asn和Gln的a-埃基活化時可能會發(fā)生分子內脫氫反應生成袱基化合物.堿性時Gln的側鏈可以環(huán)化生成酰胺 .而且不保護的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DC

24、M中溶解度很差.為了避免這些問題，可以用9-咕噸基，2, 4, 6-三甲氧節(jié)基，4, 4甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護，這四種基因均可用TFA脫除.4.4. HiHiHis是最容易發(fā)生消旋化的氨基酸，必須加以保護對咪哇環(huán)的非危N開始用節(jié)基(Bzl)和甲基磺?；?TOS)保護.但這兩種保護基均不太理想.TOS對親核試劑不穩(wěn)定，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，并且產生很大程度消旋.Boc基團是一個較理想的保護基，降低了咪哇環(huán)的 堿性，抑制了消旋，成功地進行了一些合成.但是當反復地用堿處理時，也表現出一定的不穩(wěn)定性.哌噬球基在堿中穩(wěn)定，但是沒能很好地抑制消旋， 而且脫保護時要用很強的親核試劉如.對

25、咪哇環(huán) 危N保護，可以完全抑制消旋，危N可以用節(jié)氧甲基（Bom）和叔丁氧甲基（Bum）保護，（Bum）可以用TFA脫除，Bom更穩(wěn)定些，需用催化 氫解或強酸脫保護，Bum是目前很有發(fā)展前途的His側鏈保護基，其不足之處在丁Fmoc（His）Bum在DCM和DMF中的溶解度較差.5.5. CyCyCys的SH具有強親核性，易被?；闪蝓?，也易被氧化為二硫鍵， 必須加以保護.常用保護基有三類：一類用TFA可脫除，如對甲節(jié)基、對甲 氧節(jié)基和三苯甲基等；第二類可用（CF3CO）3T1 /TFA脫除，對TFA穩(wěn)定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對弱酸穩(wěn)定，如節(jié)基和叔丁硫基（stBu）等，Cys

26、（StBu）可用筑基試劑和磷試劑還原，Cys（Bzl）可用Na/NH3（1）脫保護.6.6. ArgArgArg的月瓜基具有強親核性和堿性，必須加以保護.理想的情況是三個氮都加以保護，實際上保護1或2個月瓜基氮原子.保護基分四類：（1）硝基烷氧球基（3）磺?；?）三苯甲基.硝基在制備、?；呀庵袕V生很多副反應，應用不廣.烷氧球基應主要有Boc和二金剛烷氧球基（Adoc）2、Fmoc（Arg）Boc的耦聯反效率不高，哌噬理時不處穩(wěn)定，會發(fā)生副反應；Adoc保護了兩個非 兀-N,但有同樣的副反應發(fā)生.對磺酰基保護，其中TOS應用最廣，但它較難脫除 .近年來2, 3, 6-三甲基-4-甲氧苯橫?；?/p>

27、（Mtr）較受歡迎，在TFA作用下，30分鐘即可脫除， 但是它們都不能完全抑制側鏈的?；l(fā)生.三苯甲基保護基可用TFA脫除.缺點是反應較慢，側鏈仍有?；磻?，且其在DCM、DMF中溶解度不好.7.7. LyLyLys的&NH2必須加以保護.但與a NH2的保護方式應不同，該保護 基要到肽鏈合成后除去.b NH2的保護無消旋問題，可以采用?；Ｗo基， 其它常用的保護基有節(jié)氧碳基8.8. FmocFmoc基團的脫除Fmoc基團的所環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性，易被較弱堿除去， 反應條件很溫和.反應過程可表示如下： 哌噬進攻9-H, 6消除形成二苯協(xié)烯， 很容易被二級環(huán)胺進攻形成穩(wěn)定的加

28、成物.Fmoc基團對不同的堿穩(wěn)定性不同，可根據實際條件選用 .9.9.耦聯反應固相中的接肽反應原理與液相中基本一致.將兩個相應的氨基被保護的及埃基被保護的氨基酸放在溶液內，并不形成肽鍵.要形成酰胺鍵，經常用的手段是將?；罨? 其方法是將它變成混合酸酎， 或者將它變?yōu)榛顫婖ァ?酰氯，或者用強的失去劑 (碳二業(yè)胺)也可形成酰胺鍵。碳二業(yè)胺是常用的活化試劑， 其中Dcc使用范圍最廣， 其缺點是形成 了不溶丁DCM的DCH，過濾時乂難丁除盡.其他一些如二異丙基碳二業(yè)胺(DCI)、甲基叔丁基碳二業(yè)胺也用丁固相合成中，它們形成的脈溶丁DCM中，經洗滌可以除去.其他活化試劑，還有Bop(Bop C1)、氯

29、甲酸異丙酯、 氯甲酸異丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成對稱酸、SOC12形成 酰氯，其余三種形成不對稱酸酊。)V#e8E2c10.10.對稱酸法用Dcc形成對稱酸酎的方法使用較廣.其缺點是有些氨基酸在DCM中不易溶解，生成的Fmoc氨基酸酎溶解度更差.同時還有些副反應，如形成二肽、消旋等.â? %Bz9g n69b11.11.混合酸酎法最常用試劑是氯甲酸的異丙基酯和異丁基酯.前者得到的酸酎穩(wěn)定性好只產生很少消旋，在適當的化學計量及溶劑條件下，耦聯反應很快.而且， 在此反應中使用的N-甲基嗎琳和N-甲基哌噬對Fmoc基團無影響12.12.酰氯法在Boc法中不常用

30、的酰氯，因為比較激烈，一些保護基如Boc不穩(wěn)定.但是，Fmoc基團可以耐受酰氯處理，生成的Fmoc氨基酰氯也很穩(wěn)定.在三 甲基乙酸/三胺或苯并三氮口坐/二異丙基乙二胺中，反應速度很快，消旋 很少.酰氯法在固相合成中應用還不多，但已表明，Fmoc氨基酰氯適用丁合成有立體障礙的肽序列 .13.13.活化酯法活化酯法在固相合成中應用最為廣泛.采用過的試劑也很多，近來最常用的有HOBt 酯、ODhbt 酯、OTDO酯等.HOBt酯反應快，消旋少，用碳二業(yè)胺很容易制得；ODhbt酯很穩(wěn)定，容易進行分離純化， 與HOBt酯具有類似的反應性和消旋性能，它還有一個優(yōu)越之處， 在酰化時有亮黃色、 耦聯結束時顏色

31、消失， 有利丁監(jiān)測反應；OTDO酯與ODhbt酯類似，消旋化極低，易分離，?；瘯r伴有顏色從桔紅 色到黃色的變化等.b1Z7n+k:E5w3n2E2l714.14.原位法將碳二業(yè)胺和a- N保護氨基酸直接加到樹脂中進行反應叫做原位法.o用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化試劑還有Bop和Bop-C1等.原位法反應快、副反應少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遺憾的是Bop酰化時生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其應用15.15.裂解及側鏈保護基脫除Fmoc法裂解和脫側鏈保護基時可采用弱酸.TFA為應用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和

32、、副反應較少.不足之處：Arg側鏈的Mtr彳艮難脫除，TFA用量較大；無法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用強酸脫保護的方法：如用HF來脫除一些對弱酸穩(wěn)定的保護基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl（節(jié)基）保護基等，但是當脫除Asp的吸電子保護基時，會引起環(huán)化副反應.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫酰存在 時，脫保護速度很快.此外，根據條件不同，堿、光解、氟離子和氫解等脫 保護方法也有應用.固相合成法對丁肽合成的顯著的優(yōu)點：簡化并加速了多步驟的合成； 因反應在一簡單反應器皿中便可進行，可避免因手工操作和物料重復轉移 而產生的損失；固相載體共價相聯的肽鏈處丁適宜的物理狀態(tài)，可通過快

33、速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結晶或 分柱步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失；使用過量反應物，迫使 個別反應完全，以便最終產物得到高產率；增加溶劑化，減少中間的產物 聚焦； 固相載體上肽鏈和輕度交聯的聚合鏈緊密相混， 彼此產生一種相互 的溶劑效應，這對肽自聚集熱力學不利而對反應適宜。固相合成的主要存 在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣造成最終產物的純度不如 液相合成物，必需通過可靠的分離手段純化。多肽的不穩(wěn)定多肽的不穩(wěn)定性是其制劑研究中存在的主要問題之一，其原因較多。但對某一個多肽來說引起不穩(wěn)定的主要原因并不多。詳細研究外界條件（如PH、溫度、光照、氧濃度等）對多肽穩(wěn)定性的影響有助丁設計合理的制劑 配方。盡管添加劑穩(wěn)定多肽的機制還不十分活楚，使用添加劑仍是目前提高多肽制劑穩(wěn)定性的主要手段之一。應用CD、DSC等分析手段可幫助快速篩選道合適的添加劑。引起多肽不