中南大學生物科學與技術(shù)學院分子生物學研究中心教案

1、中南大學生物科學與技術(shù)學院分子生物學研究中心教案授課科目: 醫(yī)學分子生物學授課內(nèi)容: 蛋白質(zhì)組學的研究方法和進展授課對象：臨床醫(yī)學七年制、八年制授課時數(shù)： 4 學時授課教師：授課地點：湘雅醫(yī)學院新教學區(qū)授課時間：授課教材：醫(yī)學分子生物學（ 21 世紀高等院校教材） ，胡維新主編，北京：科學出版社， 2007 年 2 月，第一版；醫(yī)學分子生物學（衛(wèi)生部8 年制規(guī)劃教材） ，馮作化主編，北京： 人民衛(wèi)生出版社，2005，第一版第九章 蛋白質(zhì)組學的研究方法和進展一目的要求掌握： 蛋白質(zhì)組學和功能蛋白質(zhì)組學的概念； 常用蛋白質(zhì)組學研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點。熟悉： 通過質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進行鑒

2、定的實驗路線； 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實驗流程。了解：蛋白質(zhì)組的發(fā)展史；蛋白質(zhì)組學在疾病研究中的應(yīng)用。2 講授重點： 蛋白質(zhì)組學及功能蛋白質(zhì)組學的概念； 常用蛋白質(zhì)組學研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點； 通過質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進行鑒定的實驗路線；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實驗流程。3 講授難點 ： 通過質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進行鑒定的實驗路線； 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實驗流程。六、講授內(nèi)容第九章 蛋白質(zhì)組學的研究方法和進展一目的要求掌握： 蛋白質(zhì)組學和功能蛋白質(zhì)組學的概念； 常用蛋白質(zhì)組學研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點。熟悉： 通過質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進

3、行鑒定的實驗路線； 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實驗流程。了解：蛋白質(zhì)組的發(fā)展史；蛋白質(zhì)組學在疾病研究中的應(yīng)用。2 講授重點： 蛋白質(zhì)組學及功能蛋白質(zhì)組學的概念； 常用蛋白質(zhì)組學研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點； 通過質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進行鑒定的實驗路線；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實驗流程。3 講授難點 ： 通過質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進行鑒定的實驗路線； 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實驗流程。四、教學方法： 多媒體教學五、教具： 多媒體課件六、講授內(nèi)容（同八年制）人類基因組序列（human genome project, HGP揭示基因組的精細結(jié)構(gòu)，顯示了基因數(shù)量有限

4、性和基因結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定性， 與生命現(xiàn)象的復(fù)雜性和多變性之間存在著巨大反差。促使人們認識到：基因只是遺傳信息的載體?；蚪M學在基因活性和疾病的相關(guān)性方面為人類提供了有力根據(jù) , 但是基因的表達方式錯綜復(fù)雜， 同樣的一個基因在不同條件、 不同時期可能會起到完全不同的作用。 因此研究生命現(xiàn)象， 闡釋生命活動的規(guī)律， 只了解基因組的結(jié)構(gòu)是不夠的， 還須對生命活動的直接執(zhí)行者蛋白質(zhì)進行更深入的探討。 事實上對蛋白質(zhì)的數(shù)量、 結(jié)構(gòu)、 性質(zhì)、 相互關(guān)系和生物學功能進行全面深入的研究已成為生命科學研究的迫切需要和重要任務(wù)。以“蛋白質(zhì)組” （proteome）為研究對象的生命科學新時代已經(jīng)到來。第一節(jié) 蛋白質(zhì)組

5、學的概念及其發(fā)展史一、蛋白質(zhì)組學的概念蛋白質(zhì)組是澳大利亞學者Williams 和 Wilkins 于 1994 年首先提出 , 源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome兩個詞的雜合，指“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)” 。是對應(yīng)于一個基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，而不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細胞、不同組織中的表達情況各不相同，即使是同一細胞， 在不同的發(fā)育階段、 不同的生理條件甚至不同的環(huán)境影響下， 其蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)也不相同。 因此， 蛋白質(zhì)組是一個在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。 而蛋白質(zhì)組學（proteomics）是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組

6、的一門新興科學， 其目的是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、 表達水平與修飾狀態(tài)， 了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系， 揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。研究內(nèi)容主要包括：了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類；明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)的； 描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)， 揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位 與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。 蛋白質(zhì)組概念的提出標志著生命科學的一個嶄新時代 蛋白質(zhì)組時代已經(jīng)開始， 它是繼基因組研究之后的又一 “大學科 ” 。 即以蛋白質(zhì)組為研究對象， 在蛋白質(zhì)多肽譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門科學， 是通過對基因表達產(chǎn)物 蛋白

7、質(zhì)進行整體、動態(tài)、定量水平上的研究來闡述環(huán)境、疾病、藥物等對細胞代謝的影響，并分析其主要作用機理、解釋基因表達調(diào)節(jié)的主要方式。要對 “全部蛋白質(zhì)” 進行研究是非常困難的，功能蛋白質(zhì)組學的提出解決了這一難題， 其研究對象是功能蛋白質(zhì)組， 即細胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)， 它是介于對個別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對象的蛋白質(zhì)組學研究之間的層次， 并把目標定位在蛋白質(zhì)群體上， 這一群體可大可小， 從局部入手研究蛋白質(zhì)組的各個功能亞群體， 以便把多個亞群體組合起來，逐步描繪出接近于生命細胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。功能蛋白質(zhì)組學從理論和技術(shù)上使以 “全部蛋白

8、質(zhì)” 為研究對象的蛋白質(zhì)組學更具體化，更易于從時、空、量效方面動態(tài)、整體、深入地研究生理狀態(tài)下同一組織細胞在不同發(fā)育階段或同一組織細胞在不同個體間或同一基因組在不同組織細胞間， 以及病理情況下同一疾病的不同發(fā)展階段的蛋白質(zhì)表達模式和功能模式的變化，揭示一些重要的生命現(xiàn)象和一些重大疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。二、蛋白質(zhì)組學的產(chǎn)生與發(fā)展20 世紀中期以來，隨著DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的 X 射線解析，開始了分子生物學時代，對遺傳信息載體DNA 和生命功能的主要體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的研究，成為生命科學研究的主要內(nèi)容。90 年代初期，美國生物學家提出并實施了人類基因組計劃， 經(jīng)過各國科學家多年的努力，

9、 人類基因組計劃取得了巨大成績，一些低等生物的 DNA 序列已被闡明，人類DNA 序列的框架圖已經(jīng)測定，迄今已測定的表達序列標簽(EST)幾乎覆蓋了人類所有基因。在這樣的形勢下， 生命科學已進入了后基因組時代。 在后基因組時代， 生物學研究的重點已從揭示生命所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對生物功能的研究。 這種轉(zhuǎn)向的第一個標志就是產(chǎn)生了一門稱為功能基因組學的新科學。 功能基因組學的主要任務(wù)是解析和綜合大量的遺傳信息， 闡明基因遺傳信息與人類生命活動之間的聯(lián)系?；虻墓δ苁峭ㄟ^其產(chǎn)物 mRNA 和蛋白質(zhì)來體現(xiàn)的。近年來利用基因表達系列分析( serial analysis of gene exp

10、ressio，n SAGE ) 、微陣列( microarray) 和DNA芯片(chip)等新技術(shù)研究mRNA水平上的基因活動規(guī)律取得了較大進 展。但 mRNA 水平的基因表達狀況并不能完全代表蛋白質(zhì)水平的狀況， mRNA 與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.40.5,蛋白質(zhì)才是生命功能的主要執(zhí)行者，它存 在著翻譯后的加工修飾、 轉(zhuǎn)移定位、 構(gòu)象變化、 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)與其它生物大分子相互作用等自身特點， 難以從 DNA 和 mRNA 水平得到解答， 從而促使人們從組織或細胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的組成、 表達和功能模式去研究生命活動的基 本規(guī)律。 自 “蛋白質(zhì)組 ” 概念提出并開始從整體蛋白質(zhì)水平研究

11、生命現(xiàn)象以來， 蛋白質(zhì)組研究在國際上進展十分迅速。 不論是基礎(chǔ)理論， 還是技術(shù)方法， 都在不斷地進步和完善。 許多種細胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立， 相應(yīng)的國際互聯(lián)網(wǎng)站也層出不窮， 眾多的制藥廠和公司在巨大財力的支持和商業(yè)利益的誘惑下紛紛加入蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組研究的文章每年成倍增長。 1996 年澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心( Australia Proteome Analysis Facility， APAF) ，得到了政府部門的大力支持。 同年丹麥、 加拿大也先后成立了國家蛋白質(zhì)組研究中心，隨后美國、丹麥、瑞士、瑞典、英國、法國、意大利、日本和德國等也加入了蛋白質(zhì)組研究

12、行列。國際著名學府如哈佛、斯坦福、耶魯、密西根、華盛頓大學、 歐洲分子生物學實驗室、 巴士德研究所、 瑞士聯(lián)邦工業(yè)學院均擠身此類研究。如美國國立癌癥研究院（NCI）投資1 000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢月中瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。 NCI 和 FDA 共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。 英國建立三個蛋白質(zhì)組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進行蛋白質(zhì)組研究。獨立完成人類基因組測序的 Celera 公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、 細胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體， 構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)庫的工作， 以幫助研究者更深入了解細胞生理和病理過程

13、，并為藥物的開發(fā)選擇靶分子。 1997 年召開了第一次國際“蛋白質(zhì)組學”會議，預(yù)測 21 世紀生命科學的重心將從基因組學轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)組學，為生命科學和醫(yī)藥學領(lǐng)域的研究帶來了新的生機。 1998 年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白質(zhì)組學會議，參加者大都來自各大藥廠和公司。 1999 年 1 月在英國倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會議。 1999 年 5 月在日本召開的國際電泳會議上，約三分之一的文章與蛋白質(zhì)組有關(guān)。我國也于 1998 年啟動了蛋白質(zhì)組學研究。1998 年在中國科學院上海生物化學研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質(zhì)組學研討會， 并在此基礎(chǔ)上， 提出了功能蛋白質(zhì)組學的研究戰(zhàn)略。 科技部已將疾病蛋白

14、質(zhì)組研究列入我國“973”計劃項目和“863”計劃項目；國家自然科學基金委員會也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點項目。我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進展，并且于 2003 成立了中國人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO）。 并分別于 2003年 9月、 2004年 8 月以及 2005年 8 月召開了中國蛋白質(zhì)組學首屆、 第二屆及第三屆學術(shù)大會， 于 2004年 10 月在中國北京召開了第三屆國際蛋白質(zhì)組學會議。因此，蛋白質(zhì)科學及技術(shù)已經(jīng)成為 21 世紀生命科學與生物技術(shù)的重要戰(zhàn)略前沿， 是生命科學突破與生物技術(shù)創(chuàng)新的必由之路，并且成為生命科學與生物技術(shù)引領(lǐng)自然科學與技術(shù)的龍

15、頭。第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學研究方法概述蛋白質(zhì)組研究比基因組研究更復(fù)雜和困難，一方面，蛋白質(zhì)的數(shù)目大大超過基因的數(shù)目。人基因組有2.54.0萬個編碼基因，而其表達的蛋白質(zhì)可達十幾萬或更多；另一方面，基因是相對靜態(tài)的，一種生物僅有一個基因組，而蛋白質(zhì)是動態(tài)的，即隨時間和空間而變化，同時還有著復(fù)雜的翻譯后修飾。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有 20種，加上修飾的氨基酸則更多，而DNA 僅 4 種核苷酸組成。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術(shù)平臺是現(xiàn)在乃至相當一段時間內(nèi)蛋白質(zhì)組學研究中的主要任務(wù)。 最初的蛋白質(zhì)組學主要是研究蛋白質(zhì)組的組成成分，即蛋白質(zhì)組表達模式 ( expression profile)

16、 。 蛋白質(zhì)組表達模式研究的支撐技術(shù)主要有雙向凝膠電泳和以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及生物信息學。隨著學科的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學的研究范圍不斷擴展，蛋白質(zhì)組功能模式的研究不斷深入。蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用的研究已成為蛋白質(zhì)組學的重要部分。一、蛋白質(zhì)組表達模式的研究方法(一)蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質(zhì)組分進行蛋白質(zhì)組分析。 也可以進行樣品預(yù)分級， 即采用各種方法將細胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分， 分別進行蛋白質(zhì)組研究。樣品預(yù)分級的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細胞中不同的細胞器定位進行分級， 如專門分離出細胞核、 線粒體或高爾基體等細胞器的

17、蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測，還可以針對某一細胞器的蛋白質(zhì)組進行研究。對臨床組織樣本進行研究， 尋找疾病標記， 是蛋白質(zhì)組研究的重要方向之一。但臨床樣本都是各種細胞或組織混雜， 而且狀態(tài)不一。 如腫瘤組織中， 發(fā)生癌變的往往是上皮類細胞， 而這類細胞在腫瘤中總是與血管、 基質(zhì)細胞等混雜。 所以，常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進行差異比較， 實際上是多種細胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較。 最近在組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備方面已有新的進展， 如采用激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection， LCM) 方法可直接在顯微鏡下

18、從組織切片中精確分離特定的細胞或細胞群。(二)蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離利 用 蛋 白 質(zhì)的 等 電 點 和分 子量 通過 雙 向凝 膠 電 泳 (two-dimensional electrophoresis， 2-DE) 的方法將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開來是最主要的基于膠的蛋白質(zhì)組學分離技術(shù)。雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)于1975年首先由O Farrell等創(chuàng)立,其原理是第一向在高壓電場下對蛋白質(zhì)進行等電聚焦 (IEF), 再在第一向垂直方向上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。第一向的IEF電泳，經(jīng) 歷了從最初的載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳到80年代固相pH梯度等電聚焦

19、電泳(immobilized pH gradient:, IPG)的發(fā)展過程。盡管傳統(tǒng)的O'Farrell系統(tǒng)雙向電泳有較高的分辨率，曾報道可以分離到約 1 000 多種蛋白質(zhì)，但這種系統(tǒng)仍存在不少問題，如重復(fù)性，特別是第一向因陰極漂移而丟失堿性蛋白質(zhì)，載體兩性電解質(zhì)pH 梯度不穩(wěn)定，受電場和時間影響大，脲在低溫下容易在毛細管中析出影響聚合及蛋白質(zhì)分離等。 1982 年由 Bjellgvist 等發(fā)展并完善了固相 pH梯度等電聚焦技術(shù)，G?rg(1997)等成功地將之應(yīng)用于雙向電泳的第一向分離，從而克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的 pH 梯度

20、。由于可以建立很窄的 pH 范圍(如 0.05 U/cm) ，對特別感興趣的區(qū)域可在較窄的 pH 范圍內(nèi)做第二輪分析，從而大大提高了分辨率及重復(fù)性。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10100 kD 分子量的蛋白質(zhì)。目前在一張雙向電泳圖譜上已可以分離到近萬個蛋白質(zhì)點， 并且該方法具有高靈敏度和高分辨率、 便于計算機進行圖像分析處理、 可很好地與質(zhì)譜分析匹配等優(yōu)點， 因而這仍是目前分離蛋白質(zhì)組分的最好方法， 故而已成為蛋白質(zhì)組學研究不可缺少的核心技術(shù)。 但隨著蛋白質(zhì)組學研究工作的深入，常規(guī)的 2-DE 已顯出其本身固有的局限性，因此對2-DE 技術(shù)也仍在不斷完善和

21、改進之中，或者探索新的途徑和思路以補充目前所使用的常規(guī)2-DE 技術(shù)，如Pharmacia公司推出了 2DE-MS自動化系統(tǒng)以及大通量的2-DE技術(shù)，在第二向電泳中發(fā)展了 6-12 塊膠同時電泳的 Ettan 系統(tǒng)， 從而加快電泳速度和電泳的重復(fù)性，并推出了自動取點、酶解，以使2-DE 膠上所有樣品的酶解和轉(zhuǎn)移能平行化進行。前面已提到 2-DE 技術(shù)由于其高分辨率而得到廣泛應(yīng)用，但其有難以克服的缺點，如極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。而且此技術(shù)路線采用的膠內(nèi)酶解過程也費時、費力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化。為彌補雙向凝膠電泳技術(shù)的缺

22、陷，促進蛋白質(zhì)組學研究，目前發(fā)展了許多新型高分辨率、高通量、高峰容量的分離分析的非凝膠技術(shù)，如液相色譜法( liquid chromatography， LC ) 、毛細管電泳技術(shù)(capillary electrophoresis CE)等得到發(fā)展并在蛋白質(zhì)組學研究中廣泛應(yīng)用，這些非凝膠技術(shù)的應(yīng)用簡化了蛋白質(zhì)組研究步驟，又可與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化，是2-DE 技術(shù)路線的有效補充。 其中液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)( LC-MS/MS )是近幾年來發(fā)展迅速的新方法。蛋白質(zhì)混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE 的分離，然后進入 MS 系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián) MS 技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過計算

23、機聯(lián) 網(wǎng) 查詢 、 鑒 定蛋 白 質(zhì) 。 Opiteck 等首次報 道多 維色譜技術(shù)( LC/LC-MS/MS ) ，該技術(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，即帶電性及疏水性不同，用MS 分離多肽復(fù)合物。 Link 等利用蛋白質(zhì)復(fù)合物直接分析( DALPC )方法對酵母 80S 核糖體的蛋白質(zhì)進行分離鑒定， 其含有的 78 個蛋白質(zhì)中的 71 個得到準確分離和鑒定，而在相同條件下，2-DE只得到了 56個蛋白質(zhì)。Washburn等在多維 LC-MS/MS 的基礎(chǔ)上又應(yīng)用一種多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensional proteinidentfication technology)成功分離和鑒定出

24、酵母的 1484種蛋白質(zhì)，特別包括了一些在 2-DE 膠中難以獲得的低豐度蛋白質(zhì)。 但目前多維LC-MS/MS 技術(shù)主要作為2-DE-MS 技術(shù)的補充， 尚不能取代2-DE 在分離蛋白質(zhì)中的核心地位。 進一步研究和完善 2-DE 技術(shù)，對蛋白質(zhì)組學的研究仍具有重要戰(zhàn)略意義。(三)蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定對分離的蛋白質(zhì)進行鑒定是蛋白質(zhì)組學研究的又一重要內(nèi)容，常用的鑒定技術(shù)有蛋白質(zhì)微量測序、氨基酸組成分析等，但這些方法費時、費力、不易實現(xiàn)高通量分析。一種新的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 質(zhì)譜( MS )法受到了人們的重視和應(yīng)用， 它是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快， 也最具活力和潛力的技術(shù)。 其基本原理是樣品分

25、子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比(m/z)的差異來分離并確定樣品的分子量。質(zhì)譜在20 世紀初就已經(jīng)產(chǎn)生，多用于無機物或小分子有機物的鑒定，直到 80 年代末隨著 “軟電離 ”技術(shù)的出現(xiàn)而進入生物大分子(如蛋白質(zhì))的鑒定領(lǐng)域。 所謂 “軟電離 ”是指樣品分子電離時保留整個分子的完整性， 不會形成碎片離子。軟電離質(zhì)譜用于大分子的鑒定，主要有以下特點：靈敏度高、快速、能同時提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、 既可定性又可定量、 并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復(fù)雜體系。目前用于蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜主要有兩種：電噴霧質(zhì)譜( electrospray ionization mass spectrometr，y ES

26、I-MS ) 和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜( matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS ) 。 而以此為基礎(chǔ)鑒定和注釋蛋白質(zhì)主要通過兩種路線，一種是通過肽質(zhì)譜指紋圖( peptide mass fingerprinting， PMF )和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配的路線， 進行這種分析的質(zhì)譜儀首選是MALDI-TOF 質(zhì)譜儀， 另一種是通過測出樣品中部分肽段二級質(zhì)譜信息或氨基酸序列標簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配的路線，適合于進行這種分析的儀器主要是電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀。通過

27、質(zhì)譜對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點進行鑒定的實驗路線蛋白質(zhì)組研究中雙向電泳技術(shù)（2-DE）仍然是分離蛋白質(zhì)的主導技術(shù)，對2-DE 膠上蛋白質(zhì)點的鑒定， 目前普遍認為 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀進行PMF 分析是合適的第一步。而MALDI-TOF 質(zhì)譜儀由于其靈敏度高（可達fmol ） ，分析速度快， 譜圖簡單易于解析以及受緩沖液、 鹽份的干擾小等諸多優(yōu)點， 非常適合于進行 PMF 分析。對于那些數(shù)據(jù)庫比較完善的蛋白質(zhì)組樣品，在較好的儀器分析狀態(tài)下， 2-DE 膠上的蛋白質(zhì)點通過PMF 方法鑒定的成功率可達50以上。目前很多廠家都在MALDI-TOF 質(zhì)譜儀上配有自動數(shù)據(jù)搜尋分析軟件， 不僅使儀器能直接

28、給出蛋白質(zhì)鑒定的結(jié)果而且使分析的通量大大增加， 一臺儀器一天之內(nèi)分析數(shù)百個蛋白質(zhì)點已不是很困難的事。然而單靠 PMF 路線來鑒定蛋白質(zhì)并非總能獲得成功，經(jīng)常有獲得的肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫中得不到可靠的匹配的情況。其可能的原因有（ 1）由于樣品量太少， PMF 圖的信噪比太低， 因而輸入庫中搜尋的數(shù)據(jù)質(zhì)量不好；（ 2） 2-DE 膠上所取的一個蛋白質(zhì)點并非單一蛋白質(zhì)，所獲得的 PMF 圖實際上是兩個以上蛋白質(zhì)PMF 圖的混合圖；（ 3）操作中角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染；（ 4）該蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫中未有記載； （ 5）所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多；（ 6） 所分析的蛋

29、白質(zhì)是一個數(shù)據(jù)庫中沒有的未知的新蛋白質(zhì)；（ 7）有些生物材料的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫規(guī)模太小。因而在上述情況下，為了要對 PMF 方法未能鑒定的蛋白質(zhì)進行鑒定，可通過其他質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串聯(lián)質(zhì)譜信息或序列標簽（sequence tag并將其輸入數(shù)據(jù)庫中進行搜尋來鑒定該蛋白質(zhì)。 當前進行這一工作的質(zhì)譜儀多用電噴霧串行質(zhì)譜儀。尤其普遍的是ESI-離子肼和 ESI 三級四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，采用 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀的源后裂解功能（PSD） ，也能獲得多肽片段離子的信息并推導出序列，但成功率一般低于ESI-MS/MS 。近年研究中發(fā)展起來的基質(zhì)輔助激光解吸附電離 串行飛行時間（ MA

30、LDI-TOF/TOF ） 質(zhì)譜技術(shù)能更進一步提高蛋白質(zhì)序列標簽測定的通量和準確性。與此同時，儀器的自動化和相關(guān)實驗的整合使通過質(zhì)譜鑒定的技術(shù)更加高通量化。但要精確鑒定某一蛋白質(zhì)通常還得聯(lián)合幾種鑒定技術(shù)。最近，國外建立了一種將 MALDI-MS 技術(shù)直接應(yīng)用于組織切片或印片的方法，即組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)，取得了較滿意的結(jié)果。當前蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)， 即通過雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離， 然后利用質(zhì)譜對蛋白質(zhì)逐一進行鑒定。對于蛋白質(zhì)鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個關(guān)鍵指標。 一般的質(zhì)譜技術(shù)難以將三者合一， 而最近發(fā)展的新型質(zhì)譜如兩級飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（ M

31、ALDI-TOF/TOF ） 、傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（ FTMS ）使蛋白質(zhì)鑒定的靈敏性、 可靠性和通量進一步提高， 從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)準確和大規(guī)模的鑒定。另外，表面增強激光解吸/ 電離飛行時間質(zhì)譜（ SELDI-TOF-MS ）技術(shù)在臨床蛋白質(zhì)組學研究領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢， 該技術(shù)應(yīng)用基因芯片的設(shè)計理念， 把層析、 質(zhì)譜等技術(shù)合理應(yīng)用于蛋白芯片的檢測， 它不需進行蛋白質(zhì)的雙向電泳， 能快速、簡便地鑒定少量生物樣本（組織和細胞抽提物、血液、尿液、細胞培養(yǎng)上清等）中差異表達的蛋白質(zhì)。該技術(shù)在尋找腫瘤標志物方面已展現(xiàn)廣闊的前景，如基于 SELDI-TOF-MS 蛋白質(zhì)芯片分析的卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的

32、血清診斷模式已建立。（四）蛋白質(zhì)組學研究的生物信息學生物信息學是隨著人類基因組計劃、計算機技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而誕生的一門新興學科， 是蛋白質(zhì)組學的一個重要的技術(shù)平臺。 生物信息學研究生物信息的采集、加工、分析、存儲、傳播等各個方面，它通過綜合應(yīng)用數(shù)學、計算機科學、 工程科學以及生物學的技術(shù)來分析大量而復(fù)雜的生物學數(shù)據(jù)而揭示生物學的奧秘。 生物信息學是蛋白質(zhì)組學研究的一個不可缺少的部分， 其在蛋白質(zhì)組學中的研究有兩個重要應(yīng)用： 一是構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜， 二是數(shù)據(jù)庫的搜索與構(gòu)建。蛋 白質(zhì) 組數(shù) 據(jù)庫 是 蛋白 質(zhì) 組 研究水 平的標志和 基礎(chǔ)。 瑞士的SWISS-PROT 擁有目前世界上

33、最大，種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫。NRDB由SWISS-PROT和GENPETP等幾個數(shù)據(jù)庫組成。 dbEST 是由美國國家生物技術(shù)信息中心（ National Centre for BiotechnologyInformation ， NCBI ) 和歐洲生物信息學研究所(European Bioinformatics Institute，EBI ）共同編輯的核酸數(shù)據(jù)庫，包括許多生物體的表達序列標簽（ expressedsequence tags EST）。用肽序列標簽（PST）或部分序列

34、信息最適合查尋dbEST數(shù)據(jù)庫。最近有報道強調(diào)用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)查尋EST 數(shù)據(jù)庫以鑒定研究者最感興趣的未知蛋白質(zhì)的重要性，表明人類EST 數(shù)據(jù)庫能滿足用質(zhì)譜數(shù)據(jù)快速識別哺乳動物多蛋白質(zhì)復(fù)合物的要求。 生物信息學的發(fā)展已給蛋白質(zhì)組研究提供了更方便有效的計算機分析軟件； 特別值得注意的是蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定軟件和算法發(fā)展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學、UCSF等都有自主的搜索軟件和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。最近發(fā)展的質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋基因組數(shù)據(jù)庫使得質(zhì)譜數(shù)據(jù)可直接進行基因注釋、判斷復(fù)雜的拼接方式。隨著基因組學的迅速推進， 會給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫。 另外， 對肽序列標記的從頭

35、測序軟件也十分引人注目。（五）定量蛋白質(zhì)組學研究隨著蛋白質(zhì)組學研究的深入發(fā)展，人們已不再滿足對一個混合體系中的蛋白質(zhì)進行簡單的定性分析，要求更加準確的定量分析。為此，有人提出了 “定量蛋白質(zhì)組學 ”的概念。定量蛋白質(zhì)組學，就是把一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復(fù)雜體系中所有的蛋白質(zhì)進行精確的定量和鑒定。 這一概念的提出， 標志著蛋白質(zhì)組學研究已從對蛋白質(zhì)的簡單定性向精確定量方向發(fā)展， 并且成為當前蛋白質(zhì)組研究的一個熱點。 蛋白質(zhì)組研究和基因組研究相比最大的不同和難點之一是定量， 而蛋白質(zhì)表達量的差異又是影響生物功能的重要因素。 蛋白質(zhì)組定量技術(shù)現(xiàn)在還處于起步階段， 也面臨很多難點： 首先， 對

36、低豐度蛋白質(zhì)檢測的困難顯然阻礙對這些蛋白質(zhì)的定量。 其次， 當?shù)鞍踪|(zhì)表達量差異很小， 如在50%以下時，精確定量成為瓶頸。 另外， 生物體系中蛋白質(zhì)表達瞬時變化的捕捉是樣品制備中需要關(guān)注的問題， 總之， 蛋白質(zhì)組定量技術(shù)的研究和應(yīng)用還任重道遠。 目前定量蛋白質(zhì)組研究策略主要有： 基于雙向凝膠電泳的定量蛋白質(zhì)組研究策略和基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究策略等。1基于雙向凝膠電泳的定量蛋白質(zhì)組研究策略雙向凝膠電泳（ 2-DE） 作為蛋白質(zhì)組學的主要技術(shù)伴隨著蛋白質(zhì)組學的發(fā)展而發(fā)展，是目前唯一能分離展示大量蛋白質(zhì)并進行蛋白質(zhì)定量分析的一種方法，具有高通量、重復(fù)性好、分辨率極高、敏感性較高等優(yōu)點，能同時

37、分離和定量數(shù)千種甚至上萬種蛋白。雖然它有許多不盡如人意的地方 , 但依然是蛋白質(zhì)組研究的一個重要手段， 在蛋白質(zhì)分離和定量分析中顯示其獨特的魅力。 在傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳上比較兩種存在差異表達的蛋白質(zhì)組樣品時， 要將其總蛋白分別展現(xiàn)在不同的凝膠上。由于雙向凝膠電泳重復(fù)性的問題，每種樣品通常需做多次電泳，以獲得圖像的電子“平均值” ，從而使二者間的比較更有把握。同時，考馬斯亮藍與銀染蛋白質(zhì)點定量上線性動態(tài)范圍較窄， 為蛋白質(zhì)點的精確定量比較帶來限制。熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE ）是在傳統(tǒng)雙向凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的定量分析凝膠蛋白質(zhì)點的新方法， 其優(yōu)點是可以在同一塊凝膠上比較兩種不同

38、來源或不同處理的蛋白質(zhì)組表達， 能比較精確地在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)對研究者感興趣的蛋白質(zhì)進行定量， 因此成為一種有較好應(yīng)用前景的定量蛋白質(zhì)組學研究方法。 該方法首先將待比較的幾個樣品的總蛋白分別用兩種不同的熒光標記試劑（ Cy2、 Cy3 或 Cy5 ）進行標記，然后將不同熒光染料標記的幾種待比較蛋白質(zhì)等量混合，上樣進行雙向電泳， 2-DE 凝膠在成像儀上用不同的波長激發(fā)，分別將樣品的熒光圖譜成像，用 2D 分析軟件進行定量分析，對差異的蛋白質(zhì)點用MALDI-TOF-MS 或 ESI-MS 進行鑒定。熒光差異顯示雙向電泳（亦稱熒光差示雙向電泳） 與傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳最大的差別在于前者采用了熒光試劑

39、來標記蛋白質(zhì)并通過熒光成像以獲取電泳圖像。 這種方法的優(yōu)點是可以在同一塊凝膠上比較兩種不同來源或不同處理樣本的蛋白質(zhì)表達譜， 能在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)精確地對感興趣的蛋白質(zhì)進行定量。2基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究策略由于不同蛋白質(zhì)和多肽在質(zhì)譜儀中離子化能力不同，質(zhì)譜儀檢測得到的信號對來自單一樣品的蛋白質(zhì)并不具有定量功能， 所以從質(zhì)譜圖中不能得到量的信息。 但是對于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽， 可以通過比較質(zhì)譜峰的強度（或峰面積） 得到待比較蛋白質(zhì)的相對量。 根據(jù)這一原理發(fā)展了基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學分析方法。 Oda 和 Gygi 等人最先利用此原理，用一種質(zhì)量標簽標記一種狀態(tài)下的蛋白

40、質(zhì)， 然后與另一種狀態(tài)下沒有標記的蛋白質(zhì)混合起來， 進行質(zhì)譜分析， 通過比較某蛋白質(zhì)沒有標記的峰和標記后峰的強弱， 就得到這種蛋白質(zhì)在兩種狀態(tài)下表達量的變化。 這里經(jīng)常用到的內(nèi)部標準就是穩(wěn)定同位素 （如2D、 13C、 18O 和 15N ）標記的小分子，這些小分子必須滿足一定的條件：不同樣品來源的肽段標記后化學性質(zhì)是相同的； 若與高效液相色譜聯(lián)用， 標記后肽段的保留時間要盡可能相同。二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)功能模式的研究是蛋白質(zhì)組研究的最終目標。其主要研究目標是要揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、 相互協(xié)調(diào)的關(guān)系， 并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系， 以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功

41、能的關(guān)系。蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用的研究已成為蛋白質(zhì)組學的重要部分。 近年來， 隨著蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的發(fā)展， 發(fā)展了許多有效的功能蛋白質(zhì)組研究方法， 如酵母雙雜交系統(tǒng)、 噬菌體展示、 生物傳感芯片質(zhì)譜、 基因工程和蛋白質(zhì)工程中的突變表達分析、核磁共振成像、 X 線晶體衍射分析、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究隨著后基因組時代的到來和蛋白質(zhì)組學技術(shù)的迅速發(fā)展，對生物體器官、組織或細胞的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學的一項重要任務(wù)。 蛋白質(zhì)在翻譯中或翻譯后會在氨基酸鏈上共價結(jié)合各種非肽類基團， 形成翻譯后修飾，這些修飾能影響蛋白質(zhì)的物理、化學性質(zhì)、折疊狀

42、態(tài)、構(gòu)象分布、穩(wěn)定性以及活性， 而且翻譯后修飾本身可作為一個附加功能基團發(fā)揮作用。 生物體能迅速對體內(nèi)環(huán)境變化和外界環(huán)境刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)， 這些反應(yīng)過程靠復(fù)雜的調(diào)控機制調(diào)節(jié)， 其中大多數(shù)調(diào)控機制是由蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化所介導的。 而蛋白質(zhì)本身的構(gòu)象變化常常是通過變構(gòu)效應(yīng)和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上發(fā)生的各種共價修飾來實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括:糖基化、二硫鍵的配對、甲基化、乙?；?、羧基化、焦谷氨酸化、蛋白質(zhì)降解、S-硝酸化以及ADP核糖基化等二十多種，是蛋白質(zhì)行使正常生理功能所必需的。有些修飾基團只出現(xiàn)在蛋白的 N 端，與氨基酸種類無關(guān)； 有些卻只出現(xiàn)在某幾個氨基酸殘基上， 與氨基酸位置無關(guān)； 還有些修飾

43、現(xiàn)象既與氨基酸種類有關(guān)， 又與其位置有關(guān)。 這些修飾基團會影響蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和等電點， 使其在雙向電泳膠上偏離其理論位置。 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與其活性及功能狀態(tài)有關(guān)， 也與蛋白質(zhì)所在細胞的種類和生命周期相關(guān)。 完全理解特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系需要掌握多方面的信息， 而不僅僅是它的氨基酸序列， 翻譯后修飾也是非常重要的信息。 但是目前蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究面臨著以下困難： 其一、 被翻譯后修飾的蛋白質(zhì)經(jīng)常只是很少的拷貝數(shù)， 因此修飾肽的檢測需要高靈敏度的方法； 第二、 蛋白質(zhì)翻譯后修飾要求在確定其修飾位點和修飾數(shù)目的同時進行定量分析； 第三、 蛋白質(zhì)多肽之間的鍵經(jīng)常是脆弱的， 很難找到一

44、定的條件使得在修飾狀態(tài)下進行處理和電離； 第四、 已經(jīng)有超過400 種蛋白質(zhì)翻譯后修飾被發(fā)現(xiàn)，且所有可能修飾蛋白質(zhì)序列的測定工作是巨大的。所以，盡管二維凝膠電泳和質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組技術(shù)不斷完善， 但是從整體上了解蛋白質(zhì)的翻譯后修飾正面臨著巨大的挑戰(zhàn)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的靈敏度和準確度的大大提高，質(zhì)譜已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾的中堅力量， 目前蛋白質(zhì)翻譯后的修飾的解析主要采用電噴霧（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI ）兩種質(zhì)譜技術(shù)。蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化修飾在生命活動中具有重要的調(diào)控作用， 是最常見、 最重要的共價修飾方式，是目前蛋白質(zhì)組中翻譯后修飾研究的熱點。（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)生命

45、的基本過程就是不同功能蛋白質(zhì)在時空上有序和協(xié)同作用的結(jié)果。越來越多的研究顯示： 細胞中絕大多數(shù)的酶和調(diào)控過程是以蛋白質(zhì)復(fù)合體或多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實現(xiàn)的。 另外， 細胞信號轉(zhuǎn)導及病原體感染和免疫反應(yīng)等都是蛋白質(zhì)相互識別和相互作用的結(jié)果。 由于生命活動的過程與蛋白質(zhì)的相互作用密不可分， 因此， 蛋白質(zhì)相互作用的研究成為了功能蛋白質(zhì)組學的重要內(nèi)容， 現(xiàn)就蛋白質(zhì)相互作用研究的主要方法簡介如下。1酵母雙雜交系統(tǒng)細胞中含有多種蛋白質(zhì)，其中包括許多蛋白質(zhì)體系，如多酶復(fù)合體、多肽激素與受體， 酶和底物蛋白等， 通過直接分離的方法獲得某種細胞蛋白并對其進行研究是一個非常棘手的問題。 但是我們知道， 任何細胞蛋

46、白質(zhì)都是由染色體上的相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA 并進行翻譯的產(chǎn)物，細胞 cDNA 文庫在理論上含有編碼細胞全部蛋白質(zhì)的基因，因此，將細胞cDNA 文庫插入適當?shù)娜诤媳磉_載體，即可獲得一個細胞蛋白質(zhì)文庫， 通過對蛋白質(zhì)編碼基因的遺傳操作便可間接研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，確證和篩選已知蛋白質(zhì)的完整配體并闡明其生物學特性。1989年Field和Song等人在酵母細胞中設(shè)計了一種巧妙的、新的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法 酵母雙雜交系統(tǒng)（ yeast two-hybrid system） 。酵母雙雜交系統(tǒng)是以真核細胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點為基礎(chǔ)的。 真核細胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)基本相似， 由一個 DNA

47、結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （DNA-binding domain ， BD） 和一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptional activating domain， AD） 組成，這兩個區(qū)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄激活因子的功能均是不可缺少的。 酵母蛋白 GAL4 就是一個典型的轉(zhuǎn)錄激活因子，能轉(zhuǎn)錄活化酵母半乳糖苷酶（galactosidase） GAL1 和 GAL10 基因。 GAL4由881個氨基酸組成，N端1 147位氨基酸含細胞核定位序列（NLS）和與酵母 GAL1 基因啟動子上游激活序列（upstream activation sequence of GAL1, UASg）結(jié) 合的結(jié)構(gòu)域。UASg由4個17

48、 bp位點組成，每個17 bp位點均能與GAL4 BD區(qū) 結(jié)合。 GAL4 C 端 768 881 位氨基酸含GAL1 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。這兩個結(jié)構(gòu)域相互獨立但功能上又互相依賴， 它們之間只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄因子活性。根據(jù)GAL4 的這一特點,研究者分別構(gòu)建了含GAL4 BD 和AD 的兩個酵母融合蛋白表達載體， 并經(jīng)過遺傳學操作建立了含特殊基因型、 適 用于雙雜交體分析的酵母菌株。這些菌株含UASG/GAL1/ 報道基因（LacZ、 His3或Leu2）,缺失了內(nèi)源性編碼GAL4蛋白及其抑制蛋白GAL80的基因，突變了編 碼色氨酸（Trp）,亮氨酸（Leu）和組氨酸（Hi

49、s）的基因，這樣酵母本身不能對GAL1進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在缺乏Trp 、 Leu 和 His 的培養(yǎng)中不能生長， Leu、 Trp 和 His 成為選擇轉(zhuǎn)化酵母菌株的標志。實驗中，將靶蛋白 X 基因克隆在酵母BD 表達載體， 能在酵母菌中表達由 GAL4 BD 區(qū)和靶蛋白 X 組成的融合蛋白， 將待篩選蛋白 Y 基因 （或 cDNA 文庫基因） 插入至 AD 表達載體， 它能表達由 GAL4 AD 區(qū) 和蛋白 Y 組成的融合蛋白，然后將兩個表達融合蛋白的載體轉(zhuǎn)入含報道基因的酵母菌株，如靶蛋白 X 和待篩選蛋白 Y 能相互結(jié)合，則 GAL4 的 BD 和 AD 區(qū)重建為具有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，活化報

50、道基因UASG/GAL1/LacZ 轉(zhuǎn)錄，陽性菌落顯示明顯的Galactosidase活性，出現(xiàn)蘭色菌斑，從而達到從cDNA文庫中 隨機篩選靶蛋白配體的目的 （圖 9-2） 。 除顏色篩選外， 營養(yǎng)缺陷型篩選也應(yīng)用較多，通過在缺乏相應(yīng)氨基酸（如Leu、 His ）的培養(yǎng)基菌落生長與否來判斷報道基因UASG/GAL1/His3或Leu2是否表達。酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白流程圖酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用具有如下主要特點和優(yōu)勢： 不僅 能篩選（識別）已知蛋白質(zhì)的配體，而且能快速獲得蛋白質(zhì)的編碼基因，使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型之間完美的聯(lián)系起來；可以篩選cDNA文庫中編碼的、與已知蛋白質(zhì)作用的

51、成分；在細胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)間相互作用，蛋白質(zhì)可保持天然構(gòu)象， 能真實反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況， 且可免受實驗操作的影響； 該方法是通過對編碼蛋白質(zhì)的基因進行操作而間接研究蛋白質(zhì)間的相互作用，因此省去了分離靶蛋白這個非常棘手的問題；該方法敏感性高，能檢測到較弱的一過性的蛋白質(zhì)之間相互作用。正由于此項技術(shù)具有上述優(yōu)點，使之廣泛用到分析蛋白之間的相互作用，至今，利用這一系統(tǒng)已證實和篩選出了大量具有相互作用的蛋白質(zhì)，而且發(fā)現(xiàn)了許多新基因。近年來，在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，又出現(xiàn)了酵母三雜交系統(tǒng)（yeast three-hybrid system）和酵母反向雙 雜交系統(tǒng)（yeast reverse t

52、wo-hybrid system）。酵母三雜交系統(tǒng)和反向雙雜交系統(tǒng)作為雙雜交系統(tǒng)的有益補充， 在研究蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著日益重要的作用。酵母三雜交系統(tǒng)主要用于研究多蛋白質(zhì)復(fù)合體之間的相互作用，反向雙雜交系統(tǒng)可發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)間的結(jié)合解離，主要用于從大量突變體中直接篩選出導致蛋白質(zhì)間相互作用減弱的突變位點，以及發(fā)現(xiàn)可導致已知蛋白質(zhì)間特異相互作用發(fā)生解離的肽類或其它小分子物質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用也存在如下缺點：許多靶蛋白與GAL4 BD 融合后， 具有轉(zhuǎn)錄激活報道基因的功能， 從而導致假陽性結(jié)果； 如果蛋白質(zhì)需要通過翻譯后修飾才能發(fā)生相互作用，而這種特定的翻譯后修飾在酵母細胞中又不發(fā)生，

53、則導致假陰性結(jié)果；它只能研究在核內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的相互作用，而且融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建可能會影響到蛋白質(zhì)本身的活性或折疊狀態(tài)，這些因素亦可導致假陰性結(jié)果。2噬菌體表面顯示技術(shù)噬菌體顯示技術(shù)（ phage display ）是一種噬菌體表面表達篩選技術(shù)，該技術(shù)的建立基于下列三個基本因素：在噬菌體pin和pu衣殼蛋白的N端插入外源基因（待篩基因）編碼的蛋白，形成的融合蛋白，表達在噬菌體顆粒的表面；同時其保持的外源蛋白天然構(gòu)象也能被相應(yīng)的抗體或受體識別； 利用固定于固相支持物 （如酶標板） 的篩選分子 （抗體或受體） ， 采用適當?shù)挠H和篩選法（ panning） ，洗去非特異結(jié)合的噬菌體， 最終從噬菌體文庫

54、中篩選出能結(jié)合篩選分子的目的噬菌體； 外源多肽或蛋白質(zhì)表達在噬菌體的表面， 而其編碼基因作為噬菌體載體（噬菌粒）基因組的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA 測序推導出來，使得表達蛋白（表型）和編碼基因（基因型）之間有機地聯(lián)系在一起。噬菌體顯示技術(shù)應(yīng)用范圍非常廣泛，主要應(yīng)用范圍包括：篩選與特異抗體或受體相互作用的蛋白質(zhì)。研究抗體或受體的結(jié)合位點；構(gòu)建隨機肽庫、抗體庫和蛋白文庫； 改造和提高蛋白質(zhì)、 酶和抗體的生物學和免疫學特性； 研究新型多肽藥物、 疫苗和抗體； 研究涉及到蛋白質(zhì)與核酸相互作用的生物學過程和新型的基因治療導向系統(tǒng)等。噬菌體顯示技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用具有如下主要優(yōu)點：可在細菌外完

55、成對外源多肽、蛋白質(zhì)和抗體的研究并方便地獲得目的分子DNA序列。高度的選擇性，每一次親和篩選出的噬菌體感染大腸桿菌后，該噬菌體可得到 1 000倍甚至更多的擴增， 幾次循環(huán)后， 可得到相互作用的序列； 可以構(gòu)建大的噬菌體文庫，親和純化可在高濃度（103噬菌體/ml）下進行；以往對生物大分子的相互作用研究需要對篩選分子結(jié)構(gòu)有詳細了解， 而此項技術(shù)克服了研究蛋白質(zhì)相互作用的這種限制， 這也是其得以廣泛運用的直接原因。 但該技術(shù)也存在著一些局限性， 包括： 多價展示中對于肽段大小的限制； 外源蛋白質(zhì)在宿主細菌中有時無法正確折疊或修飾； 構(gòu)建的融合蛋白有可能會影響到蛋白質(zhì)本身的活性。3基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)

56、相互作用研究方法蛋白質(zhì)鑒定是研究蛋白質(zhì)相互作用的重要步驟，而質(zhì)譜（ mass spectrometry,MS）分析技術(shù)的引入是蛋白質(zhì)鑒定中最重要的技術(shù)突破，它具有高通量、靈敏、準確、自動化等特點，已逐步取代傳統(tǒng)的 Edman 降解測序和氨基酸組成分析，成為蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)， 已廣泛用于二維電泳、 色譜分離的蛋白質(zhì)， 以及蛋白質(zhì)復(fù)合體的鑒定。 基于質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用的基本步驟主要由三個部分組成：靶蛋白制備，蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化，蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定。 蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化方法主要有傳統(tǒng)的親和層析和免疫共沉淀， 以及新型的串聯(lián)親和純化（TAP）和生物傳感器技術(shù)（如Biacore技術(shù)）。根據(jù)純化蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法的不同，可將基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法分為以下幾種。（ 1）親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)親和層析是一種傳統(tǒng)的純化蛋白質(zhì)復(fù)合體、研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。其基本原理是將某種蛋白質(zhì)以共價鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖） 上作為誘餌， 讓含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細胞