犬細胞間粘附分子酶聯免疫分析(ELISA)(共3頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上犬細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定熱犬血清，血漿及相關液體樣本中細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）的含量。實驗原理：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中犬細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）水平。用純化的犬細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54），再與HRP標記的細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物T

2、MB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中犬細胞間粘附分子1（ICAM-1/CD54）濃度。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1個1個 酶標包被板1×481×962-8保存標準品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8保存標準品稀釋液1.5ml×1瓶1.5

3、ml×1瓶2-8保存酶標試劑3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8保存樣品稀釋液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8保存顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8保存顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8保存終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8保存濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8保存樣本處理及要求：1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清

4、，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左

5、右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20保存，但應避免反復凍融.7. 不能

6、檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1.        標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100l，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50l，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100l分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50l，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50l棄掉，再各取50l分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50l分別加到第七、第八孔中，再

7、在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50l，混勻后從第七、第八孔中分別取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50l，混勻后從第九第十孔中各取50l棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為1800ng/L，1200ng/L ，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。2.         加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品10l（樣品zui終

8、稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.         溫育：用封板膜封板后置37溫育30分鐘。4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒

9、后棄去，如此重復5次，拍干。6.         加酶：每孔加入酶標試劑50l，空白孔除外。7.         溫育：操作同3。8.         洗滌：操作同5。9.         顯色：每孔先加入顯色劑A50l，再加入顯色劑B50

10、l，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘.10.     終止：每孔加終止液50l，終止反應（此時藍色立轉黃色）。11.     測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。注意事項：1  試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。2  濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。3 &

11、#160;各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間zui好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。4  請每次測定的同時做標準曲線，zui好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。5  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6  底物請避光保存。7  嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.8  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。9  本試劑不同批號組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用