紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量

1、 教材1 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量 一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理 ； 掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù) ； 掌握TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。 二、 實(shí)驗(yàn)原理 紫外-可見吸收光譜法 又稱紫外-可見分光光度法，它是研究分子吸收 190nm 750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為根底而建 立起來的一類分析方法。 紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍遷的 結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。 進(jìn)行定性：利用紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比擬法。即將 未知純化合物的吸

2、收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對強(qiáng)度以及吸收峰的形 狀與純化合物的吸收光譜進(jìn)行比擬。 定量分析：紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯 -比爾定律： A=lgI o/I= bc,當(dāng)入射光波長 入及光程b 一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的 吸光度A與該物質(zhì)的濃度 c成正比，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度成線 形關(guān)系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃 度和含量。由于最大吸收波長入max處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測量入max的 吸光度，以獲得最大靈敏度。 光度分析時(shí)，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為 b的兩個(gè)吸收池中，讓一 束一定波長的平行

3、單色光非別照射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強(qiáng)度為 I。，通過待測溶液的透光強(qiáng)度為 I ,根據(jù)上式，由儀器直接給出 Io與I之比的對數(shù) 值即吸光度。 紫外-可見分光光度計(jì)：紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計(jì)， 它 的主要部件有五個(gè)局部組成，即 由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光 ， 該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器 上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度 A。可見光區(qū)采用鴇燈 光源、玻璃吸收池；紫外光區(qū)采用覺燈光源、石英吸收池。 本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。 蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨

4、酸殘基的 苯環(huán)含有共軸雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)， 其最大吸收峰位于 280 nm 附近不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差異 。在最大吸收波長處， 吸光度與蛋白質(zhì)溶液 的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性， 且穩(wěn)定性 好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)。 酸的紫外吸收光浩 特點(diǎn)：帶光譜 分子光譜 應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長 定量分析-朗伯-比爾定律標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)參加法 根據(jù)朗伯一比耳定律: A=& bc,只要繪出以吸光度 A為縱坐標(biāo)，濃度 c為橫坐 標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度值，即未知 樣的含量

5、。 三、儀器與試劑 TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)，比色管，吸量管 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液 0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液 四、實(shí)驗(yàn)步驟 一準(zhǔn)備工作 1. 2. 量條件 3. 4. 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，翻開主機(jī)電源開關(guān)，啟開工作站并初始化儀器。 在工作界面上選擇測量工程 光譜掃描，光度測量，本實(shí)驗(yàn)選擇光度測量， 設(shè)置測 測量波長等。 將空白放入測量池中，點(diǎn)擊 START掃描空白，點(diǎn)擊 ZEROK零。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。 二 1. 測量工作 吸收曲線的繪制： 用吸里管吸取2mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于 10mL比色管中，用 0.9% NaCl 溶液稀釋至刻 度，

6、搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm 400nm區(qū)間，測量吸光度。 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 : 用吸量管分別吸取 0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5 mL 5.00 mg.mL-1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)溶液于5只10 mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用 1 cm石 英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 W 記錄所得讀數(shù)。 3. 樣品測定: 取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液 3 mL,按上述方法測定 278 nm處的吸光度。平 行測定三份。 五、數(shù)據(jù)處理： 1. 以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸

7、收曲線，找出最大吸收波長。 由吸收曲線可得最大吸收波長 入max=278nn(圖略) 2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL) 吸光度A 0.25 0.171 0.50 0.335 0.75 0.482 1.00 0.637 1.25 0.796 A度光吸 濃度C-吸光度A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186 曲線擬合優(yōu)度：R2=0.9998 3. 根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。 平行測定次數(shù) 樣品液吸光度A 樣品溶液濃度C(mg/mL) 1 0.676 1.059 2 0.672 1.053 3 0.674 1.056 所測溶液平均濃度： C=(G+G+G)/3=1.056 mg/mL 測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差： S= /Xi X) 2/(n - 1) =0.003 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差： R S D= S =0.284% 待測蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。 六、 思考題： 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？受哪些因素的影響和限制？ 優(yōu)點(diǎn)：該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品， 低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：儀器昂貴