動(dòng)物細(xì)胞基因工程技術(shù)

1、 具有復(fù)雜的翻譯后加工系統(tǒng) 糖基化以及二硫鍵在合成和分泌過 程中自然而然的正確形成 產(chǎn)生正確折疊和完全生物活性的蛋 白質(zhì) 瞬時(shí)表達(dá) 穩(wěn)定表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)瞬時(shí)基因表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)簡單、有效的外源蛋白表達(dá)手段，其表達(dá)水平最高可以達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞表達(dá)水平。蛋白質(zhì)是由未整合的、不復(fù)制的質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的，這樣使得蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間相對(duì)短，只有48h到7天。穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)需要得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株，需要12個(gè)月的時(shí)間，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，DNA被整合到染色體中，這使得重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以一代接一代地產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征表達(dá)的蛋白質(zhì)能正確加工、修飾并折疊；糖基化等修飾能保證糖蛋白行使功能；表達(dá)產(chǎn)物分泌

2、到培養(yǎng)液，容易分離純化。u細(xì)胞生長緩慢，生產(chǎn)效率較低；u連續(xù)細(xì)胞系導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加；u對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻和敏感；u可能有潛在的致病因子、免疫原性存在；u表達(dá)載體的改進(jìn)和宿主細(xì)胞的改造較為復(fù)雜。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征安全：桿狀病毒無致病性，安全性受FDAFDA認(rèn)可。易飼養(yǎng)：飼養(yǎng)，發(fā)育快。高量表達(dá)：用強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因可超量表達(dá)。高效表達(dá)：可容納較大的外源基因（12kb12kb）翻譯后的加工使大部分產(chǎn)物顯示出良好的活性。u重組率低，篩選困難，周期長。u外源基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)染的晚期，這對(duì)表達(dá)不利。u糖基化等加工途徑與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不完全相同構(gòu)建高效表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染

3、動(dòng)物細(xì)胞：人源細(xì)胞株系，哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系，昆蟲細(xì)胞株系篩選鑒定：選擇劑，報(bào)告基因獲得生產(chǎn)用工程化細(xì)胞系 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建 質(zhì)粒穿梭載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法1. 磷酸鈣共沉淀法2. DEAE-Dextran法3. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法4. 電穿孔法5. 基因槍法6. 超聲波法7. 受體介導(dǎo)法1. 磷酸鈣共沉淀法 把供體DNA溶解在HEPES溶液中，然后緩慢加入Na2HPO4-CaCl2溶液，供體DNA便被包裹在磷酸鈣溶液中，這種共沉淀可被細(xì)胞吞噬，外源基因便導(dǎo)入了受體細(xì)胞。2. DEAE-Dextran法 將DNA溶液溶解在TBS含Tris、K、Na等緩沖液中，與二乙胺乙基葡萄糖（DEAE-Dextr

4、an）混合，滴加到受體細(xì)胞表面，供體DNA便會(huì)進(jìn)入受體細(xì)胞。3. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇或其它脂類形成的一種可以高效包裝DNADNA的人造單層膜。其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，因而二者易于融合，DNADNA則由于細(xì)胞的內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。 脂質(zhì)體+無抗、無血清1640質(zhì)粒+無抗、無血清1640孵育20min與細(xì)胞（4-6105/ml）混合+無抗、有血清16404-6小時(shí)補(bǔ)充正常培養(yǎng)基、24小時(shí)加G4184. 電穿孔法（electroporation） 將供體DNA與受體細(xì)胞混勻，在高壓電場作用下，給細(xì)胞一個(gè)電脈沖，引起受體細(xì)胞出現(xiàn)瞬間可逆性開啟，外源DNA便乘機(jī)通過膜孔進(jìn)入細(xì)胞。

5、5. 基因槍法 將DNA與對(duì)人類無明顯毒副作用而對(duì)DNA有良好吸附能力的微細(xì)金粒結(jié)合，在高壓電場的作用下，金粒以極高的速度帶入人體外的細(xì)胞內(nèi)或直接帶入人體內(nèi)。 6. 超聲波法 超聲波可對(duì)細(xì)胞膜直接作用，使細(xì)胞膜的通透性增高，DNA DNA 可通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞。本法對(duì)于懸浮和貼壁生長的細(xì)胞均適用，并且超聲波可通過培養(yǎng)瓶瓶壁發(fā)揮作用。7. 受體介導(dǎo)法 此方法依賴于受體和配體間的特異結(jié)合所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用而將外源基因?qū)爰?xì)胞。一般是將DNA與多聚物（如多聚賴氨酸）結(jié)合而濃縮，再結(jié)合以一定的配體即可用于基因轉(zhuǎn)移。不過效果仍不理想。 病毒載體1.反轉(zhuǎn)錄病毒 反轉(zhuǎn)錄病毒被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)基因治療最有希望的

6、載體之一，其主要優(yōu)點(diǎn)是：基因轉(zhuǎn)移的效率高，細(xì)胞宿主范圍較廣泛，DNA整合效率高于其它病毒載體。AV比較安全，它進(jìn)入細(xì)胞后不能整合到染色體上，因此沒有激活原癌基因和使功能基因失活的危險(xiǎn)。AV不需要宿主細(xì)胞的分裂增殖就能進(jìn)入細(xì)胞，這一特性允許它可在分化的以及有最低分裂能力的細(xì)胞中進(jìn)行感染并使轉(zhuǎn)基因得以表達(dá)。 AV載體的缺點(diǎn)是其免疫原性較強(qiáng)，易受機(jī)體免疫系統(tǒng)的中和作用而失活，不能整合到宿主細(xì)胞基因組也使得外源基因表達(dá)持續(xù)的時(shí)間很有限，AV載體插入外源DNA的能力也有限（7kb）。 2. 腺病毒AAVAAV的一個(gè)重要特性是其基因組整合到人基因組中時(shí)具有高度特異性，在人染色體19q13.4-ter19q

7、13.4-ter部位有一個(gè)單一的整合位點(diǎn)?？梢哉fAAVAAV具有AVAV基因轉(zhuǎn)移的高效性和RTVRTV基因表達(dá)的持續(xù)性，而且減少了RTVRTV隨機(jī)整合可能導(dǎo)致的危險(xiǎn)。 AAVAAV的缺點(diǎn)是其轉(zhuǎn)基因的裝載能力有限。完全的病毒基因組僅有4.7 kb DNA4.7 kb DNA， 插入外源DNADNA的長度自然也非常有限。3. 3. 腺病毒相關(guān)病毒 HSV是嗜神經(jīng)組織的，有把基因轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛能 HSV基因組是長152kb的雙股DNA分子。病毒融合到神經(jīng)元的膜上并被轉(zhuǎn)運(yùn)到核。復(fù)制周期由潛伏期和裂解期組成。在潛伏期，病毒基因組被壓縮并且至少兩個(gè)潛伏相關(guān)的啟動(dòng)子被活化。在裂解期，病毒被復(fù)制并產(chǎn)生

8、病毒粒子。 HSV載體不能整合到宿主細(xì)胞基因組，因此表達(dá)持續(xù)的時(shí)間有一定限度。4. 單顯性皰疹病毒 痘病毒在人類歷史上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，因此使用痘病毒做為基因轉(zhuǎn)移載體的安全性是勿容置疑的。痘病毒基因組DNA長達(dá)186 kb, 推測外源基因的容量可達(dá)30kb。痘病毒可感染非分裂的細(xì)胞，因此可適用的細(xì)胞型比較廣泛。 其缺點(diǎn)是不能整合入細(xì)胞基因組，故外源基因表達(dá)的時(shí)間不能持久，載體過大，受免疫系統(tǒng)的影響也較大。5. 痘病毒質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方法1. 磷酸鈣共沉淀法2. DEAE-Dextran法3. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法4. 電穿孔法5. 基因槍法6. 超聲波法7. 受體介導(dǎo)法6. 超聲波法 超聲波可對(duì)細(xì)胞膜直接作用，

9、使細(xì)胞膜的通透性增高，DNA DNA 可通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞。本法對(duì)于懸浮和貼壁生長的細(xì)胞均適用，并且超聲波可通過培養(yǎng)瓶瓶壁發(fā)揮作用。AV比較安全，它進(jìn)入細(xì)胞后不能整合到染色體上，因此沒有激活原癌基因和使功能基因失活的危險(xiǎn)。AV不需要宿主細(xì)胞的分裂增殖就能進(jìn)入細(xì)胞，這一特性允許它可在分化的以及有最低分裂能力的細(xì)胞中進(jìn)行感染并使轉(zhuǎn)基因得以表達(dá)。 AV載體的缺點(diǎn)是其免疫原性較強(qiáng)，易受機(jī)體免疫系統(tǒng)的中和作用而失活，不能整合到宿主細(xì)胞基因組也使得外源基因表達(dá)持續(xù)的時(shí)間很有限，AV載體插入外源DNA的能力也有限（7kb）。 2. 腺病毒AAVAAV的一個(gè)重要特性是其基因組整合到人基因組中時(shí)具有高度特異性，在人染色體19q13.4-ter19q13.4-ter部位有一個(gè)單一的整合位點(diǎn)?？梢哉fAAVA