基因組序列的詮釋

1、問問 題題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個整體如何行使其功能？基因組作為一個整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因，研究基因的功能呢？用什么方法尋找基因，研究基因的功能呢？1基因組序列的詮釋基因組序列的詮釋 研究基因組的最終目的不是為了僅僅得到基因組的研究基因組的最終目的不是為了僅僅得到基因組的全部序列全部序列，而是詮而是詮釋基因組所包含的釋基因組所包含的信息信息和基因組和基因組功能功能。在這一部分中，我們主要探討利用。在這一部分中，我們主要探討利用什么方法來搜尋基因和研究基因組的功能什么方法來搜尋基因和研究基因組的功能1. 1. 在基

2、因組中搜尋基因在基因組中搜尋基因 根據(jù)順序分析搜尋基因根據(jù)順序分析搜尋基因 實驗分析確認基因?qū)嶒灧治龃_認基因2. 2. 基因功能的測定基因功能的測定25.1 在基因組中搜尋基因一、根據(jù)序列分析搜尋基因根據(jù)序列分析搜尋基因A A 起始密碼子起始密碼子 ATG ATG B B 信號肽分析信號肽分析C C 終止密碼子終止密碼子D 3D 3端的確認端的確認E E 非編碼序列、內(nèi)含子非編碼序列、內(nèi)含子F F 密碼子偏愛性密碼子偏愛性G G 外顯子內(nèi)含子邊界外顯子內(nèi)含子邊界H H 上游調(diào)控序列上游調(diào)控序列I I 軟件預(yù)測軟件預(yù)測3在獲得基因組或在獲得基因組或DNADNA序列后，可以采用人序列后，可以采用人

3、工或計算機序列篩選的方法來獲得基因。工或計算機序列篩選的方法來獲得基因。目前，使用比較多的方法是目前，使用比較多的方法是ORFORF（opening reading opening reading framesframes）掃描）掃描 ORFORF：每個編碼蛋白的基因都含有：每個編碼蛋白的基因都含有ORFORF，它是由一系列密碼子組成，通常以，它是由一系列密碼子組成，通常以ATGATG開始，開始，TAATAA、TGATGA、TAGTAG結(jié)束。通過尋找起始密碼子和終止密碼子的結(jié)束。通過尋找起始密碼子和終止密碼子的ORFORF序列是尋找基因的一種序列是尋找基因的一種重要的方法重要的方法 尋找尋找O

4、RFORF的成功的關(guān)鍵在于的成功的關(guān)鍵在于終止碼終止碼在在DNADNA序列中出現(xiàn)的頻率序列中出現(xiàn)的頻率4CG含量含量50%終止子出現(xiàn)終止子出現(xiàn)的頻率的頻率64bp才可才可能出現(xiàn)能出現(xiàn)一次一次5終止碼出現(xiàn)的頻率與終止碼出現(xiàn)的頻率與CG含量之間的關(guān)系含量之間的關(guān)系高等真核生物高等真核生物DNA的的ORF的閱讀障礙：的閱讀障礙： 基因間存在大量基因間存在大量非編碼序列非編碼序列（人類基因組（人類基因組占占70%） 很多基因含有很多基因含有內(nèi)含子內(nèi)含子 由于多數(shù)外顯子長度由于多數(shù)外顯子長度Sequence Prediction: Signal peptide Signal peptide probab

5、ility: 0.767 Signal anchor probability: 0.000 Max cleavage site probability: 0.313 between pos. 31 and 32 15C C 、終止密碼子、終止密碼子 終止密碼子終止密碼子: TAA, TAG,TGA: TAA, TAG,TGA GC% = 50% GC% = 50% 終止密碼子每終止密碼子每 64 64 bpbp出現(xiàn)一次出現(xiàn)一次 GC% 50% GC% 50% 終止密碼子每終止密碼子每100100200 200 bpbp 出現(xiàn)一次出現(xiàn)一次 由于多數(shù)基因由于多數(shù)基因 ORF ORF 均多于均多于5

6、050個密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是個密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是 ORF ORF 不少于不少于100 100 個密碼子個密碼子16D D、33端的確認端的確認 33端的確認主要根據(jù)端的確認主要根據(jù)Poly(A)Poly(A)尾序列，若測尾序列，若測試試DNADNA片段不含片段不含Poly(A)Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信序列，則根據(jù)加尾信號序列號序列“AATAAA”AATAAA”和和BLASTBLAST同源性比較結(jié)果共同判斷同源性比較結(jié)果共同判斷171825561 caggccgaca aatcgcctta tgctagcccg gggggtggaa tgatccggat atgct

7、gatgattg 25621 tggggcaggt aggctggggc gaaaaccttc attcttctaa ccttacgccc tatgaacaat 25681 atgcgcacat cagtttatgg agcctgctat cggctccatt gctaatcggg tgcgatttga 25741 gtaaactcga tgcctttacc ttgaatttgc tgaaaaacaa ggaggtaata gtattagatc 25801 aggacactct tggaaagcag gcaatccgaa ctgttaatat tggcggtgta caagtatggg 258

8、61 aaaaaaagct ttcggatggc ggacttgcca taggcgtttt taacctgaat gataaatatt 25921 gccgatatac cttacgttta acgcgtagaa aacacccggt aaatattata cgggatttat 25981 ggattcaaaa ggacgttaaa aaaaatgtcg gcactgtgtt gtttcaagtg ccacctcatg 26041 gggtcaagct tctgaatatt aaaggcagtt agtatcatta aatatggtca aatggttgct 26101 atgttagga

9、t aaattccaac gttaattgac acctacaggt gattactttt gaattagttt 26161 tgtgaataaa agtgtctgtg ttcgtcaatt agtgtctgtg ttcgtcaatt tatcttttat cgaaaataat aatgcatctt 26221 atacaataat ttatttaatt gttaacgatg ggagttagtt ttttcgtcaa ggtcaattct 26281 tacaagacag ttatagttag ttagttagtt agttgattaa gatggccgtc tcaatttg 19E E 、

10、非編碼序列、內(nèi)含子、非編碼序列、內(nèi)含子 高等真核生物多數(shù)外顯子長度少于高等真核生物多數(shù)外顯子長度少于100 100 個密碼子，有的不到個密碼子，有的不到5050個個密碼子甚至更少密碼子甚至更少20F F 、密碼子偏愛性、密碼子偏愛性 編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第差別僅在密碼子的第3 3位堿基不同位堿基不同 不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（人類基因中，丙氨酸（AleAle）密碼子多為）密碼子多為GCA,GCCGCA,GCC或或GCT,GCT,而而GCG

11、GCG很少使用很少使用21G G 、外顯子內(nèi)含子邊界、外顯子內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征如：內(nèi)含子的如：內(nèi)含子的55端或稱供體位（端或稱供體位（donor sitedonor site）常見的順序為常見的順序為 5 -AG5 -AGGTTAAGT-3GTTAAGT-333端又稱受體位（端又稱受體位（acceptor site)acceptor site)，多為，多為5PyPyPyPyPyPyCAG-3 5PyPyPyPyPyPyCAG-3 ( (PyPy：嘧啶核苷酸，：嘧啶核苷酸，T T或或C)C)22 H H、 上游調(diào)控序列上游調(diào)控序列

12、幾乎所有基因（或操縱子）上游都有幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控調(diào)控序列，它們與序列，它們與DNADNA結(jié)結(jié)合蛋白作用，控制基因表達合蛋白作用，控制基因表達 TATAAT,TGATCATATAAT,TGATCA, ,通過通過同源同源性比較來預(yù)測性比較來預(yù)測mRNAmRNA的的55端，最常用的與端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點轉(zhuǎn)錄起始位點相關(guān)的數(shù)據(jù)庫是真核相關(guān)的數(shù)據(jù)庫是真核啟動子啟動子數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫(The TRADAT Project , (The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. Eukaryotic Promoter Dat

13、abase, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )http:/www.epd.unil.ch/ )另外個別生物基因組的另外個別生物基因組的特有組成特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動物也可作為判別依據(jù)，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有基因組許多基因的上游都有CpGCpG島島 23I I 、軟件預(yù)測、軟件預(yù)測采用采用NCBINCBI的的ORFORF預(yù)測軟件預(yù)測軟件 ( ( ORF finderORF finder: : /gorf/orfig.cgi )/gorf/orf

14、ig.cgi )判斷判斷ORFORF的可的可能范圍能范圍24 適用于高等真核生物基因組的適用于高等真核生物基因組的ORFORF掃描方法：掃描方法： 上游調(diào)控序列（上游調(diào)控序列（upstream control sequenceupstream control sequence）：上游調(diào)控序列和外顯子）：上游調(diào)控序列和外顯子- -內(nèi)含子內(nèi)含子邊界一樣具有顯著特征，這些特征是參與基因表達的邊界一樣具有顯著特征，這些特征是參與基因表達的DNADNA結(jié)合蛋白的識別信號。但真結(jié)合蛋白的識別信號。但真核的變化也較大核的變化也較大 同源查詢同源查詢（homology searchhomology searc

15、h）：利用已存入數(shù)據(jù)庫中的基因序列與待查基因組序）：利用已存入數(shù)據(jù)庫中的基因序列與待查基因組序列進行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例用于界定基因的方法列進行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例用于界定基因的方法 孤獨基因孤獨基因（orphan geneorphan gene）：指在基因分類時缺少同源順序的）：指在基因分類時缺少同源順序的ORFORF25二、實驗分析確認基因二、實驗分析確認基因分子雜交分子雜交可確定可確定DNADNA片段是否含有表達順序片段是否含有表達順序 Northern blotNorthern blot：指將待測：指將待測DNADNA樣品標(biāo)記后與樣品標(biāo)記后與

16、RNARNA雜交，以判斷雜交，以判斷RNARNA中是否含有中是否含有DNADNA的的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但在操作中存在一些問題轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但在操作中存在一些問題 Zoo blotZoo blot：一些親緣關(guān)系相近的物種，其：一些親緣關(guān)系相近的物種，其基因的編碼區(qū)基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低。則可以某一物種的同源性很低。則可以某一物種的DNADNA序列與來自另一親緣種的序列與來自另一親緣種的DNADNA片段雜交，如產(chǎn)生片段雜交，如產(chǎn)生陽性信號，則該區(qū)段可能含有陽性信號，則該區(qū)段可能含有1 1或多個基因或多個基因26問題問題解決方案解決方案某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行可變剪

17、接某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行可變剪接或該基因為某一多基因家族的成員或該基因為某一多基因家族的成員時，會出現(xiàn)多個雜交帶時，會出現(xiàn)多個雜交帶設(shè)計其他實驗區(qū)分設(shè)計其他實驗區(qū)分基因的表達具有組織特異性及發(fā)育基因的表達具有組織特異性及發(fā)育階段的差別，而選擇的階段的差別，而選擇的RNARNA樣品中樣品中不一定含有該基因產(chǎn)物不一定含有該基因產(chǎn)物盡可能多地收集各種不同發(fā)盡可能多地收集各種不同發(fā)育時期及不同組織器官的育時期及不同組織器官的RNARNA某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取適當(dāng)適當(dāng)提高提高RNARNA上樣量上樣量，或先，或先以已知的以已知的DNADNA序列序列設(shè)計引物設(shè)計引物從從

18、mRNAmRNA中中擴增擴增基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物27 DNADNA順序中基因位置的確定順序中基因位置的確定 Northern blotNorthern blot和和Zoo blotZoo blot可以判斷可以判斷DNADNA片段中是否含有基因，但是不能片段中是否含有基因，但是不能給出基因定位信息。獲得基因定位信息的最容易的方法是給出基因定位信息。獲得基因定位信息的最容易的方法是cDNAcDNA測序測序 cDNAcDNA測序受兩個方面的影響：測序受兩個方面的影響： 一是相關(guān)一是相關(guān)cDNAcDNA在在cDNAcDNA文庫中出現(xiàn)的頻率；文庫中出現(xiàn)的頻率； 二是二是cDNAcDNA的完整性的完整性28

19、如何獲取基因全長如何獲取基因全長cDNAcDNA序列序列 ？確定其在基因？確定其在基因組中的位置？組中的位置？ A cDNA A cDNA 文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建 B RACE B RACE 技術(shù)技術(shù) C C 通過對全長通過對全長cDNAcDNA序列的測序、對比，以及序列的測序、對比，以及與與基因組基因組DNADNA的比較的比較，確定基因所在的區(qū)域；，確定基因所在的區(qū)域；通過物種已建立通過物種已建立遺傳圖遺傳圖和和物理圖物理圖來確定基因來確定基因的位置；的位置；2930cDNA文庫構(gòu)建(CLONTECH)SMART原則（S=Specific、M=Measurable、A=Attainable、R=R

20、elevant、T=Time-based）31cDNA文庫構(gòu)建325RACE(CLONTECH)333RACE(CLONTECH)5.2 基因功能的測定基因功能的測定一一. 利用計算機分析基因功能利用計算機分析基因功能二二. 實驗分析確定基因功能實驗分析確定基因功能三三. 其他的基因功能研究方法其他的基因功能研究方法四四. 主要技術(shù)及原理方法主要技術(shù)及原理方法34一一.利用計算機分析基因功能利用計算機分析基因功能1. 1.同源性確定基因功能同源性確定基因功能2. 2.同源性分析在酵母基因組計劃中的應(yīng)用同源性分析在酵母基因組計劃中的應(yīng)用351. 1.同源性確定基因功能同源性確定基因功能 同源基因

21、都擁有一個共同的祖先基因，它們之間有同源基因都擁有一個共同的祖先基因，它們之間有許多相似的序列。同源基因可以分為許多相似的序列。同源基因可以分為2類：類： 種間同源種間同源基因或基因或直系基因直系基因（orthologous gene）：）：指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分化指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分化以前的共同祖先以前的共同祖先 種內(nèi)同源種內(nèi)同源基因或基因或平行平行基因（基因（paralogous gene） 同一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因家族的同一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因家族的不同成員，其共同祖先可能存在于物種形成以后，不同成員，其共同祖先可能存在于

22、物種形成以后，也可能存在于物種形成之前也可能存在于物種形成之前36同源基因一般不會有同源基因一般不會有完全一致完全一致的核苷酸序列，的核苷酸序列，因為不同的基因或不同的生物都會獨立地發(fā)生隨機因為不同的基因或不同的生物都會獨立地發(fā)生隨機突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷酸酸位置位置是是相同相同的。的。 當(dāng)一個新基因的序列被確認后，根據(jù)同源性當(dāng)一個新基因的序列被確認后，根據(jù)同源性可以從數(shù)據(jù)庫中查找已知序列的同源基因。根據(jù)進可以從數(shù)據(jù)庫中查找已知序列的同源基因。根據(jù)進化的相關(guān)性，可以根據(jù)已知的同源基因推測化的相關(guān)性，可以根據(jù)已知的同源基因推測新基

23、因新基因的功能。的功能。 同源性分析可以給出整個基因或其中某一區(qū)同源性分析可以給出整個基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)段功能的有關(guān)信息信息37 1 aatcggcgct gccccagcag ggctgcggct gcaggcaggc agagcctcct agcccgtcgg 61 tgtctgcgcc catcgatccc tttgtctatc cccgaccatg gcgaagctga ttgcgctcac 121 cctcttgggg atgggactgg cactcttcag gaaccaccag tcttcttacc aaacacgact 181 taatgctctc cgagaggt

24、ac aacccgtaga acttcctaac tgtaatttag ttaaaggaat 241 cgaaactggc tctgaagact tggagatact gcctaatgga ctggctttca ttagctctgg 301 attaaagtat cctggaataa agagcttcaa ccccaacagt cctggaaaaa tacttctgat 361 ggacctgaat gaagaagatc caacagtgtt ggaattgggg atcactggaa gtaaatttga 421 tgtatcttca tttaaccctc atgggattag cacatt

25、caca gatgaagata atgccatgta 481 cctcctggtg gtgaaccatc cagatgccaa gtccacagtg gagttgttta aatttcaaga 541 agaagaaaaa tcgcttttgc atctaaaaac catcagacat aaacttctgc ctaatttgaa 601 tgatattgtt gctgtgggac ctgagcactt ttatggcaca aatgatcact attttcttga 661 cccctactta caatcctggg agatgtattt gggtttagcg tggtcgtatg ttgt

26、ctacta 721 tagtccaagt gaagttcgag tggtggcaga aggatttgat tttgctaatg gaatcaacat 781 ttcacccgat ggcaagtatg tctatatagc tgagttgctg gctcataaga ttcatgtgta 841 tgaaaagcat gctaattgga ctttaactcc attgaagtcc cttgacttta ataccctcgt 901 ggataacata tctgtggatc ctgagacagg agacctttgg gttggatgcc atcccaatgg 961 catgaaaat

27、c ttcttctatg actcagagaa tcctcctgca tcagaggtgc ttcgaatcca 1021 gaacattcta acagaagaac ctaaagtgac acaggtttat gcagaaaatg gcacagtgtt 1081 gcaaggcagt acagttgcct ctgtgtacaa agggaaactg ctgattggca cagtgtttca 1141 caaagctctt tactgtgagc tctaacagac cgatttgcac ccatgccata gaaactgagg 1201 ccattatttc aaccgcttgc cat

28、attccga ggacccagtg ttcttagctg aacaatgaat 1261 gctgacccta aatgtggaca tcatgaagca tcaaagcact gtttaactgg gagtgatatg 1321 atgtgtaggg cttttttttg agaatacact atcaaatcag tcttggaata cttgaaaacc 1381 tcatttacca taaaaatcct tctcactaaa atggataaat cagttatgtc aattgtcaga 1441 tattaaataa cagtgtgtga ccccaaaagt acttaccc

29、ta aaacatgtgt tgcctggaag 1501 cacatgtgtg tatcgctgcc ttgccatgtc ttgttcagaa gacacagggg agcagggtta 1561 gctcacgtgt ctttagaact ccagtactca cccagggact ccagttcaca ggccagaaaa 1621 catatgcatt atgaagttcc cctctactcc atgcacatag taagtctgac tatggcagtc 1681 agacttactt actcccattt tcccttcgat atatgacttt ttctcagtaa at

30、attaacct 1741 gaattattcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaa2. 2.同源性分析在酵母基因組計劃中的應(yīng)同源性分析在酵母基因組計劃中的應(yīng)用用酵母基因組大約含有酵母基因組大約含有6000個基因，個基因，30是通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的，是通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的，另外另外70是用同源性分析獲得是用同源性分析獲得405.2 基因功能的測定基因功能的測定二二. 實驗分析確定基因功能實驗分析確定基因功能1. 1. 基因基因失活失活在基因功能分析的作用在基因功能分析的作用2. 2. 基因的基因的超表達超表達用于功能檢測用于功能檢測411. 1.基因失活基因失活在基因功能分析的作

31、用在基因功能分析的作用基因的功能是一個過程，是從基因到表型的一系基因的功能是一個過程，是從基因到表型的一系列生理生化反應(yīng)過程?，F(xiàn)在的基因功能研究與傳列生理生化反應(yīng)過程。現(xiàn)在的基因功能研究與傳統(tǒng)的遺傳分析正好相反，傳統(tǒng)的遺傳分析是從統(tǒng)的遺傳分析正好相反，傳統(tǒng)的遺傳分析是從表表型型出發(fā)最終到達出發(fā)最終到達基因基因（正向遺傳學(xué)正向遺傳學(xué)），而在基因），而在基因組計劃中研究基因功能則是從基因出發(fā)，最終到組計劃中研究基因功能則是從基因出發(fā)，最終到達表型（達表型（反向遺傳學(xué)反向遺傳學(xué)）。因此必須尋找一系列的）。因此必須尋找一系列的實驗方法來鑒別與目標(biāo)基因相關(guān)的表型。實驗方法來鑒別與目標(biāo)基因相關(guān)的表型?；?/p>

32、失活基因失活是基因功能分析的主要手段。是基因功能分析的主要手段。42 基因失活基因失活 基因剔除（基因剔除（knock-out） 反義反義RNA技術(shù)技術(shù) 轉(zhuǎn)座子插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變43 基因剔除（基因剔除（knock-out） 最簡單的基因失活方法，將一段無關(guān)的最簡單的基因失活方法，將一段無關(guān)的DNA片段用來取代目標(biāo)基因。片段用來取代目標(biāo)基因。 主要原理：用一段無關(guān)的核苷酸序列主要原理：用一段無關(guān)的核苷酸序列取代取代目標(biāo)基因的目標(biāo)基因的中間中間序列，并將其導(dǎo)序列，并將其導(dǎo)入生物體內(nèi)或目的細胞內(nèi)，如果該基因所控制的表型變化了，就從反面驗入生物體內(nèi)或目的細胞內(nèi)，如果該基因所控制的表型變化了，就從

33、反面驗證了目標(biāo)基因的功能。證了目標(biāo)基因的功能。44 反義反義RNA技術(shù)技術(shù) 反義反義RNA由基因的負鏈（模板鏈的互補鏈）編碼，可以與由功能基因轉(zhuǎn)錄由基因的負鏈（模板鏈的互補鏈）編碼，可以與由功能基因轉(zhuǎn)錄而成的正義而成的正義RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，干擾干擾mRNA的翻譯，從而干擾基因的表達的翻譯，從而干擾基因的表達 將基因的將基因的編碼序列反向編碼序列反向插入表達載體，插入表達載體，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物，獲得轉(zhuǎn)基因個體或品目標(biāo)生物，獲得轉(zhuǎn)基因個體或品系后，進一步分析表達的反義系后，進一步分析表達的反義RNA在生理生化或形態(tài)發(fā)生中所起的作用，由此在生理生化或形態(tài)發(fā)生中所起的作用，由此判別目標(biāo)

34、基因的功能判別目標(biāo)基因的功能 轉(zhuǎn)座子插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變 將轉(zhuǎn)座子隨機插入功能基因內(nèi)，使其失活，也可以用于基因功能研究。將轉(zhuǎn)座子隨機插入功能基因內(nèi)，使其失活，也可以用于基因功能研究。 452. 2. 基因的超表達用于功能檢測基因的超表達用于功能檢測 在正常情況下，基因產(chǎn)物的數(shù)量是有限制的，必須與其它基因的產(chǎn)物在正常情況下，基因產(chǎn)物的數(shù)量是有限制的，必須與其它基因的產(chǎn)物平衡平衡，某一基因產(chǎn)物的過量和不足都會破壞這種平衡，造成生長和發(fā)育的異常某一基因產(chǎn)物的過量和不足都會破壞這種平衡，造成生長和發(fā)育的異常 有兩種技術(shù)可以使細胞中某一基因過量表達：有兩種技術(shù)可以使細胞中某一基因過量表達： 增加基因的

35、增加基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)； 采用采用強啟動子強啟動子46 許多蛋白質(zhì)必須與其他蛋白質(zhì)互作，才能表現(xiàn)其功能，當(dāng)鑒定了這類蛋白質(zhì)的某些成許多蛋白質(zhì)必須與其他蛋白質(zhì)互作，才能表現(xiàn)其功能，當(dāng)鑒定了這類蛋白質(zhì)的某些成員，則可采用某些方法分離與之互作的其他蛋白質(zhì)員，則可采用某些方法分離與之互作的其他蛋白質(zhì) 噬菌體展示噬菌體展示 （phage display） 酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-hybridization）47三三. 其他的基因功能研究方法其他的基因功能研究方法 噬菌體展示噬菌體展示 檢測的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，表達后可產(chǎn)生檢測的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，表達后可產(chǎn)生融合

36、外殼蛋白融合外殼蛋白，當(dāng)噬菌體，當(dāng)噬菌體遇到可與融合外殼蛋白遇到可與融合外殼蛋白互作的蛋白質(zhì)互作的蛋白質(zhì)時會發(fā)生時會發(fā)生聚合聚合48酵母菌雙雜交系統(tǒng)酵母菌雙雜交系統(tǒng) 真核生物中，轉(zhuǎn)錄因子與基因上游的特定真核生物中，轉(zhuǎn)錄因子與基因上游的特定DNA序列結(jié)合，然后激活序列結(jié)合，然后激活RNA聚合酶，起始聚合酶，起始RNA的合成。的合成。 轉(zhuǎn)錄因子有轉(zhuǎn)錄因子有2個重要的功能區(qū)域，一個與個重要的功能區(qū)域，一個與啟動子啟動子區(qū)域的區(qū)域的DNA序列結(jié)合，另一個與序列結(jié)合，另一個與RNA聚合酶聚合酶的激活有的激活有關(guān)。有些轉(zhuǎn)錄因子中的關(guān)。有些轉(zhuǎn)錄因子中的這這2個片段即使分割開來，仍然個片段即使分割開來，仍然可

37、以在可以在同一個細胞內(nèi)相互作用，同一個細胞內(nèi)相互作用，裝配裝配成一個完整的、有成一個完整的、有功能的轉(zhuǎn)錄因子。功能的轉(zhuǎn)錄因子。 49酵母菌雙雜交系統(tǒng)中，將編碼這酵母菌雙雜交系統(tǒng)中，將編碼這2個功能域的個功能域的DNA分分別構(gòu)建在別構(gòu)建在2個獨立的表達載體上。個獨立的表達載體上。在一個表達載體中，在一個表達載體中，DNA結(jié)合功能域結(jié)合功能域的基因片段與的基因片段與待待測蛋白質(zhì)測蛋白質(zhì)的基因連接成融合基因。的基因連接成融合基因。在另一個載體中，在另一個載體中，RNA聚合酶激活功能域聚合酶激活功能域的基因片段的基因片段與與未知的未知的DNA序列序列連接成融合蛋白基因。連接成融合蛋白基因。將這將這2個

38、表達載體同時轉(zhuǎn)化一個細胞，并在細胞內(nèi)表達，個表達載體同時轉(zhuǎn)化一個細胞，并在細胞內(nèi)表達，如果如果DNA結(jié)合功能域蛋白與同結(jié)合功能域蛋白與同RNA聚合酶激活功能聚合酶激活功能域蛋白之間能夠互作，就會啟動報告基因的表達。域蛋白之間能夠互作，就會啟動報告基因的表達。50四四 主要技術(shù)及原理方法主要技術(shù)及原理方法4.1 4.1 基因剔除基因剔除(knock-out)(knock-out) 最簡便的基因失活的方法最簡便的基因失活的方法. . 主要原理主要原理: : 在一段無關(guān)在一段無關(guān)DNA DNA 片段的兩側(cè)連接與代換片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的順序基因兩側(cè)相同的順序, ,將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細胞將

39、這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細胞, ,由于由于同源同源片段之間的片段之間的重組重組, ,可使無關(guān)片段取代靶可使無關(guān)片段取代靶基因基因, ,整合到染色體中整合到染色體中. .為了便于篩選為了便于篩選, ,用于取代用于取代的外源的外源DNADNA中含有報告基因中含有報告基因. . 5152tk 胸苷激酶標(biāo)記基因 gangcyclovirneor 新霉素抗性基因G418534.2 4.2 基因超表達基因超表達 通過增加基因的通過增加基因的拷拷貝數(shù)貝數(shù)和采用和采用強啟動子強啟動子促使促使基因基因超表達超表達，致使受體表，致使受體表現(xiàn)出生長與發(fā)育的異?，F(xiàn)出生長與發(fā)育的異常, ,來來研究基因的功能研究基因的功能. .

40、54 4.3 4.3 反義反義RNARNA 反義反義RNARNA是由基因的負鏈編碼是由基因的負鏈編碼, ,可與正義可與正義RNA (sense RNA)RNA (sense RNA)或或DNA DNA 編碼順編碼順序結(jié)合序結(jié)合, ,干擾干擾mRNA mRNA 的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄, ,加工和轉(zhuǎn)運加工和轉(zhuǎn)運, ,調(diào)控基因的表達調(diào)控基因的表達. .55 構(gòu)建反義構(gòu)建反義RNA RNA 表達載體表達載體: : 將全目的基因或部分目的基因反向插入表達載體將全目的基因或部分目的基因反向插入表達載體 轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物 獲得轉(zhuǎn)獲得轉(zhuǎn)基因個體或品系基因個體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異分

41、析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判判別目的基因的功能別目的基因的功能56p3301-HbF(11030bp)300bpHbF35S proNco ISpe I Bst EIIp3301-HbR(11030bp)300bpHbR35S proNco IBst EII57正義表達載體正義表達載體反義表達載體反義表達載體 反義反義RNA RNA 作用機理：作用機理： A A 干擾翻譯的起始與延伸干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNARNA，隨之被細胞降解。隨之被細胞降解。 B B 與與mRNA mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，

42、阻止核糖體的附著，使的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動翻譯無法啟動。 C C 反義反義RNARNA與與mRNAmRNA形成雙鏈分子后，使形成雙鏈分子后，使RNARNA多聚酶脫離模板多聚酶脫離模板, ,轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止。584.4 RNAi4.4 RNAi干擾干擾 RNAiRNAi干擾是通過干擾是通過雙鏈雙鏈RNARNA的介導(dǎo)的介導(dǎo), ,特異性地降解相應(yīng)特異性地降解相應(yīng)序列的序列的mRNA,mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄后水平的從而阻斷相應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄后水平的基因基因沉默沉默機制機制. .59RNAi RNAi 作用機理作用機理A A dsRNAdsRNA核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切

43、酶DicerDicer被激活被激活, ,它把它把dsRNAdsRNA加工成加工成2121-25-25個核苷個核苷酸長的酸長的RNARNA鏈鏈; ;B B 這些小片段這些小片段RNA(RNA(siRNAsiRNA) )作為另一個核糖核酸復(fù)合體作為另一個核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-RISC(RNA-induce silencing induce silencing complex,RNAcomplex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體誘導(dǎo)沉默復(fù)合體) )的指引物的指引物, ,結(jié)合到結(jié)合到RISCRISC上上, ,使之識別并降解使之識別并降解mRNA,mRNA,從而導(dǎo)致與從而導(dǎo)致與雙鏈雙鏈RNARNA同源同

44、源的基因沉默的基因沉默; ;6061RNAiRNAi設(shè)計方法及應(yīng)用設(shè)計方法及應(yīng)用A Fraser Fraser 合成合成與開放讀碼框相對應(yīng)的雙鏈與開放讀碼框相對應(yīng)的雙鏈RNARNA或利用或利用細菌克隆表達細菌克隆表達這些雙鏈這些雙鏈RNARNA微量注射微量注射/ /喂食喂食干擾同源基因的表達干擾同源基因的表達B Chuang B Chuang 等設(shè)計出嵌合體結(jié)構(gòu)等設(shè)計出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強啟動子大量表達雙鏈連接強啟動子大量表達雙鏈mRNAmRNA干擾同干擾同源基因的表達源基因的表達6263HbF基因的基因的RNAi載體構(gòu)建載體構(gòu)建RNAiRNAi技術(shù)的優(yōu)缺點技術(shù)的優(yōu)缺點 RNAiRNAi最根本的

45、特點是特異性最根本的特點是特異性 RNAiRNAi具有特殊的具有特殊的穿越能力穿越能力, ,如將雙鏈如將雙鏈RNARNA注射在線蟲注射在線蟲性腺性腺里里, ,它也會干擾到它也會干擾到體細胞體細胞里里的基因表達的基因表達, ,而且干擾作用會而且干擾作用會傳給后代傳給后代; ; 對一些低水平表達的基因，對一些低水平表達的基因，RNAiRNAi現(xiàn)象并不明顯現(xiàn)象并不明顯 RNAiRNAi能同時作用于幾個有相同或相似序列的基因能同時作用于幾個有相同或相似序列的基因644.5 4.5 酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-yeast two-hybridizationhybridization） 原

46、理：原理： 其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動子之間的互作。轉(zhuǎn)錄因子其原理涉及轉(zhuǎn)錄因子與啟動子之間的互作。轉(zhuǎn)錄因子 （包括兩個功能區(qū)域）（包括兩個功能區(qū)域） 結(jié)結(jié)合功能域合功能域同基因上游的區(qū)段結(jié)合同基因上游的區(qū)段結(jié)合 激活功能域激活功能域激活激活RNARNA多聚酶多聚酶 將基因轉(zhuǎn)錄為將基因轉(zhuǎn)錄為mRNA mRNA 65 酵母雜交系統(tǒng)中： 融合表達載體1 融合表達載體266DNA結(jié)合功能域結(jié)合功能域+目的片段目的片段激活功能域激活功能域+ 多種未知多種未知cDNA 融合表達載體1同一細胞 融合表達載體2 形成聚合物，啟動形成聚合物，啟動報告基因的表達報告基因的表達表達載體共轉(zhuǎn)化表達載體共轉(zhuǎn)化675.3

47、從基因組到細胞 轉(zhuǎn)錄本組transcriptome DNA芯片分析 SAGE 蛋白質(zhì)組proteome68DNA芯片分析 芯片表面原位直接合成寡聚核苷酸, 一百萬個寡聚核苷酸/cm2 熒光標(biāo)記樣品cDNA，雜交，掃描，根據(jù)雜交位置確定序列 一次實驗可同時檢測成千上萬個基因的表達譜，可提供大量有關(guān)基因相互作用的信息695.3 基因芯片v何為生物芯片? 生物芯片主要指通過平面微細加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。 它是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義 的科學(xué)技術(shù)革命。D N A C h ip s P r

48、o te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s基因芯片基因芯片基因芯片的主要應(yīng)用基因芯片的主要應(yīng)用基因表達檢測 擬南芥、酵母基因表達研究等突變檢測 BRCA基因外顯子、CFTR基因、-地中海貧血、酵母突變菌株、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測等基因組多態(tài)性分析 人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定及分系析，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等基因文庫作圖 通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖 基因芯片研制的總體藍圖基因芯片研制的總體藍圖 研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測樣品 的制備探針陣列的準(zhǔn)備檢測設(shè)備的研制雜交

49、檢測與數(shù)據(jù)分析表達芯片的制備檢測流程表達芯片的制備檢測流程 表達芯片實例PCR法從外周血淋巴細胞cDNA文庫擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物點樣于包被的玻片上DNA 芯片熱擊T細胞cDNA未處理的細胞cDNA 雜交 雜交激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)17個差異表達基因,11個被熱誘導(dǎo),6個被熱抑制,發(fā)現(xiàn)其中3個為未發(fā)現(xiàn)的新基因SAGE：基因表達系列分析 轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列， 含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽 標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體，克隆測序，用SAGE軟件分析 確定表達基因種類，并根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達豐度785.2 SAGESAGE （serials anal

50、ysis of gene expression）基因表達系列分析 1995 Velculescu 及其同事年創(chuàng)立SAGESAGE特點：特點： 進行轉(zhuǎn)錄物組研究，也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究； 通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達信息； SAGE區(qū)別于差異顯示、消減雜交等其它技術(shù)的主要特點是可用于尋找那些較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基因組的基因表達信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達、構(gòu)建基因表達圖譜的首選策略； SAGE可用于在不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)及不同生長階段的細胞和組織表達圖譜構(gòu)建，對不同狀態(tài)下基因表達水平的定量或定性比

51、較，特別是對疾病組織與正常組織的比較發(fā)展迅速； SAGE SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)：技術(shù)的主要理論依據(jù)： 來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）； 通過簡單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達風(fēng)度（abundance）。 1. 將5g含有oligo dT（引物）的磁珠與RNA混合。2. 合成雙鏈cDNA。 3. 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標(biāo)簽的產(chǎn)物。 4.

52、將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5. 用Mme I切割每一個樣品形成約60bp的標(biāo)簽。SAGE 步驟步驟6. 延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。 7. PCR擴增。8. 用Nla 酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標(biāo)簽。9. 連接片斷形成串聯(lián)體。 10. 克隆到pZErO-1+里，并測序。 SAGE實例實例 蛋白質(zhì)組proteome 分析全部蛋白質(zhì)組所有成分、數(shù)量，確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、生物活性和特定功能。 目前還缺乏比較理想的技術(shù)來分析細胞中整個蛋白質(zhì)組分。 雙向電泳分離蛋白質(zhì)或多肽，隨后再測定每個電泳斑點蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸8

53、5 蛋白質(zhì)組分析的復(fù)雜性 許多加工方式，如磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化、法尼基化、二硫鍵 1個基因可編碼許多不同的蛋白質(zhì)，表現(xiàn)為組織特異性 蛋白質(zhì)之間存在大量的相互作用，如形成同源或異源二聚體、三聚體、多聚體，不同的結(jié)合狀態(tài)有不同的活性； 1 種蛋白質(zhì)可參與多種反應(yīng)，或多種蛋白質(zhì)參與1種反應(yīng)。86 在線蟲中鑒定了29個與發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì) 借助已有的基因組序列擴大蛋白質(zhì)功能的搜尋范圍，尋找所有不同基因組中同時出現(xiàn)或同時丟失的蛋白質(zhì)成員，它們表現(xiàn)出協(xié)同進化 多肽功能域 緊密連鎖基因，組成獨立的進化單位。盡管它們的表達調(diào)控相互獨立，但在功能上彼此相關(guān) 參與同一細胞事件（細胞分裂與凋亡）的基因表現(xiàn)

54、為共調(diào)節(jié) 搜集生理生化過程及特定細胞事件（癌變中）上調(diào)或下調(diào)的mRNA 利用蛋白質(zhì)微陣技術(shù)查找互作蛋白、小分子多肽和配位體結(jié)合的蛋白質(zhì)8788gene 2786.6479 /gene=mom-5 /locus_tag=T23D8.1 CDS join(2786.3258,3758.4122,4187.4325,4866.5107,5220.5340,5688.5906,6332.6479) 2641 caaactatta actaaataat gttgaacttc ttctatacat ataaccaaaa aaactatttc 2701 tttaataatt ttttatattt tcagacgaat cctgctatga actaacactt gtcaatctga 2761 aatctcttca aaactatcaa ttacaatgatgca tcgacatatt ctgatattat ttttattcgg 2821 atgcttatca gctgatcaac gactctcatc aacttcaatt tcatcgatga atggattctc 2881 aacaactcga aaatgtgaac atattacaat tccaatgtgc aaaaatctgg attacaatca 2941 aacagtattt ccaaatc