基因工程制藥節(jié)

1、第三章第三章基因工程制藥基因工程制藥基因工程的基礎(chǔ)知識基因工程的基礎(chǔ)知識 第一節(jié)第一節(jié) 基因的概念與特性基因的概念與特性 一、基因的概念: : DNA分子中含有分子中含有特定遺傳信息特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。能單位。 早期認為遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，早期認為遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，1944年年Avery從肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗證明是從肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗證明是DNA。A A：S S有夾膜致病菌，有夾膜致病菌，B B：R R突變非突變非致病菌，C C：加熱殺死：加熱殺死S S菌，菌，D D：活：活R R死死S S二、基因的一般特性：二、基因的一般特

2、性：基因可自我復(fù)制基因可自我復(fù)制基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因可突變?；蚩赏蛔??；虬垂δ芊譃椋夯虬垂δ芊譃椋航Y(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)控基因調(diào)控基因三、三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能的結(jié)構(gòu)與性能 DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（A、T、 C、 G）連接。）連接。 DNA二級結(jié)構(gòu)雙螺二級結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)。旋結(jié)構(gòu)。 DNA的性質(zhì)與功能的性質(zhì)與功能吸收光譜吸收光譜260電場中泳動電場中泳動變性、復(fù)性、雜交變性、復(fù)性、雜交第二節(jié)第二節(jié) DNADNA的復(fù)制與表達的復(fù)制與表達一、一、DNADNA的復(fù)制：的復(fù)制：半保留復(fù)制半保留復(fù)制 二二、基因表達基因表達 轉(zhuǎn)錄：在轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以

3、聚合酶的催化下以DNA為模板合為模板合成成mRNA的過程。的過程。 轉(zhuǎn)錄后加工：轉(zhuǎn)錄后加工： 剪切：除去內(nèi)含子剪切：除去內(nèi)含子 加帽：加帽：5加加m7Gppp 加尾：加尾：3加加poly（A） 二、翻譯：翻譯：以以mRNA為模板，為模板，tRNA作為運載工具，將活化的氨作為運載工具，將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過程程。 分為三個階段：分為三個階段： 起始起始 延長延長 終止終止 基因表達基因表達真核細胞的翻譯過程真核細胞的翻譯過程翻譯后的肽鏈加工翻譯后的肽鏈加工肽鏈切斷肽鏈切斷羥基化羥基化糖基化糖基化磷酸化磷酸化乙?；阴；?基因工程制藥基因工程制藥第一節(jié)第

4、一節(jié) 概概 述述 20 20世紀(jì)世紀(jì)7070年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。 19821982年年第一個基因工程產(chǎn)品第一個基因工程產(chǎn)品-人胰島素人胰島素在美國問世。在美國問世。 優(yōu)點優(yōu)點: :大量生產(chǎn)、應(yīng)用臨床、深入研究、擴大應(yīng)用、改造不足、擴大了大量生產(chǎn)、應(yīng)用臨床、深入研究、擴大應(yīng)用、改造不足、擴大了藥物篩選來源藥物篩選來源 ?；蚬こ趟幬?基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。量生

5、產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。主要是醫(yī)主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽類：用活性蛋白和多肽類：（1 1）免疫性蛋白免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體，如各種抗原和單克隆抗體（2 2）細胞因子細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、表，如各種干擾素、白細胞介素、表皮生長因子、凝血因子等皮生長因子、凝血因子等（3 3）激素激素，如胰島素、生長激素、心鈉素等，如胰島素、生長激素、心鈉素等（4 4）酶類酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化物物 歧化酶等歧化酶等利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（1）：大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽蛋白和多肽(

6、 (如胰島素、干擾素、細胞因子等如胰島素、干擾素、細胞因子等) )，為臨床使用，為臨床使用提供有效的保障；提供有效的保障；可以提供可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進行深入的研究，從而擴大這些理、生化和結(jié)構(gòu)進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；物質(zhì)的應(yīng)用范圍；可以可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點（2）：內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不存在的不足足之處，可以之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改

7、造和去除改造和去除。如。如白細胞介素白細胞介素-2-2的第的第125125位半胱氨位半胱氨酸酸是游離的，有可能引起是游離的，有可能引起S SS S鍵的錯配而鍵的錯配而導(dǎo)致活性下降，如導(dǎo)致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或?qū)⒋税腚装彼岣臑榻z氨酸或丙氨酸丙氨酸，白細胞介素，白細胞介素-2-2的的活性活性以及以及熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性均均有提高有提高。利用基因工程技術(shù)可利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物獲得新型化合物，擴大藥擴大藥物篩選來源物篩選來源。 國際上已進入臨床試驗的國際上已進入臨床試驗的抗腫瘤抗腫瘤重組導(dǎo)向毒素重組導(dǎo)向毒素 基因工程基因工程抗腫瘤藥物抗腫瘤藥物 目前進入臨床試驗的基因組重組目前進

8、入臨床試驗的基因組重組抗血管抗血管生成藥物生成藥物 轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖動物轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖動物的乳汁產(chǎn)生的人生物醫(yī)藥的乳汁產(chǎn)生的人生物醫(yī)藥 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的藥物蛋白生產(chǎn)的藥物蛋白 部分基因工程藥物簡介：1、人胰島素(InsuIin)胰島素是多肽激素的一種，具有多種生理功能，在胰島素是多肽激素的一種，具有多種生理功能，在維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)與控制細胞內(nèi)多種代謝途徑蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)與控制細胞內(nèi)多種代謝途徑等方面都有重要作用。等方面都有重要作用。胰島素用于臨床糖尿病的胰島素用于臨床糖尿病的醫(yī)治已有近醫(yī)治已有近70年的歷史

9、，長期以來，年的歷史，長期以來，其來源僅僅其來源僅僅是從動物的胰臟中提取是從動物的胰臟中提取，而動物胰島素與人胰島，而動物胰島素與人胰島素在氨基酸組成上存有一定的差異，長期注射人素在氨基酸組成上存有一定的差異，長期注射人體時會產(chǎn)生體時會產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)自身免疫反應(yīng)，影響治療效果。自，影響治療效果。自80年代初開始，人們已開始用基因工程技術(shù)大量生年代初開始，人們已開始用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)人胰島素。產(chǎn)人胰島素。 人胰島素的基因工程生產(chǎn)一般采用兩種方式：一是分別在大腸桿菌中合成A鏈和B鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。美國EIi Lilly公司采用該法生產(chǎn)的重組人胰島素Humulin最

10、早獲準(zhǔn)商品化； 另一種方法是用分泌型載體表達胰島素原，如丹麥Novo Nordisk公司用重組酵母分泌產(chǎn)生胰島素原，再用酶法轉(zhuǎn)化為人胰島素。對胰島素的改造 Novo Nordisk研究所的Brange等應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在胰島素分子中取代一個氨基酸殘基，防止單體二聚化，由此合成的新型胰島素在藥物濃度下基本上保持單體，注射后吸收速度比正常胰島素快2-3倍；另有報道將胰島素B鏈第10位的His變?yōu)锳sp獲得高活力胰島素B10Asp，其受體結(jié)合能力和離體生物活力分別為豬胰島素的262和235。 2人生長激素(Human growth hormone，hGH) 人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細胞分泌的

11、一種非糖基化多肽激素。它有多種生物功能，主要是刺激身體生長。最近發(fā)現(xiàn)hGH對一些細胞的增殖和分化以及DNA合成有直接效應(yīng)。hGH的主要用途是治療誅儒癥，臨床試驗認為hGH對慢性腎功能衰竭和Turner綜合癥也有很好療效。 美國的Genentech公司采用枯草芽泡桿菌系統(tǒng)表達hGH，產(chǎn)量達1.5g/L，于1985年10月批準(zhǔn)上市，商品名稱為Prptropin(hGH)。1994年3月又有新產(chǎn)品Nutyopin被批準(zhǔn)上市。英國Cell teck公司用哺乳動物細胞生產(chǎn)的hGH，比從垂體中提純的天然hGH多一個蛋氨酸，其治療效果更為顯著。我國用E.coli和哺乳動物細胞表達hGH，1995年開始進行臨

12、床試驗做完臨床試驗后有兩家公司進行工業(yè)化生產(chǎn)。 3、干擾素(Interferon，IFN)干擾素是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。干擾素是一種類似多肽激素的細胞功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，是一種細胞素。其定義包括如以下含義：(1)干擾素必須是一種蛋白質(zhì)；(2)在一般生理狀態(tài)下，細胞的干擾素基因呈靜止?fàn)顟B(tài)，只有在特定誘生劑作用下進行轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯出具有種屬特異性的干擾素；(3)干擾素本身不能直接滅活病毒，而是細胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋白。從而阻斷病毒的繁殖；(4)干擾素必須具有廣譜抗病毒活性。 根據(jù)抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)的不同，

13、干擾素可分為、三型。干擾素的基本特性包括種屬特異性、作用“廣譜性和選擇性”、相對無害性和特殊穩(wěn)定性等。干擾素的生物功能活性可歸納為：(1)抗細胞內(nèi)侵害微生物活性，(2)抗細胞分裂活性，(3)調(diào)節(jié)免疫功能活性。干擾素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病。 我國衛(wèi)生部已批準(zhǔn)生產(chǎn)的干擾素品種有：IFN1b、IFN2a、IFN2b和IFNr四種。 4白細胞介素(Interleukin, IL)白細胞介素是由白細胞或其他體細胞產(chǎn)生的又在白細胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子，是一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑。目前已發(fā)現(xiàn)的白細胞介素已達15種之多，它們的生物學(xué)功能十分廣泛主要功能有：(1)激活并刺激T、B淋巴細胞的

14、增殖和分化；(2)刺激巨噬細胞和粒細胞的活性；(3)作為各種細胞的絲裂原；(4)其他功能(抗腫瘤作用、誘導(dǎo)發(fā)熱、作為佐劑等)。白細胞介素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等)。 隨著分子生物學(xué)的進展，各種白細胞介素的基因也相繼克隆成功，并制成基因工程白細胞介素純品，其中有幾種已投放市場。同內(nèi)IL-2已批準(zhǔn)生產(chǎn)，IL-3、IL-4和IL-6等其他白細胞介素也正在研制中。應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在IL-2中125位Cys分別由Ser或Ala取代，制成生物活性、熱穩(wěn)定性和復(fù)性效果都比原IL-2強的新型IL-2(125Ser-IL-2和125Ala-IL-2)，現(xiàn)己獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用。5

15、. 集落刺激因子(Colony stimuLating factor, CSF)集落刺激因子(CSF)是一類能參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子，故又稱造血刺激因子或造血生長因子。 CSF的功能可概括為：刺激造血細胞增殖、維系細胞存活、分化定型、刺激終末細胞的功能活性等。近年來的研究表明，CSF還參與對成熟細胞的功能調(diào)節(jié)，并在宿主抗感染免疫中起著重要作用?，F(xiàn)在已知的集落刺激因子(CSF)主要有4種：(1)粒細胞集落刺激因子(G-CSF)；(2)巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)；(3)粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GM-C3F)；(4)多能集落刺激因子(Multi-CSF，即IL-3)。上述4種CSF在

16、注入人體后均有促使各類白細胞增殖和成熟、增加血小板和紅細胞數(shù)量的作用，因此CSF在臨床上多用作癌化療的輔佐藥物，如化療后產(chǎn)生的中性白細胞減少癥，也用于骨髓移植促進生血作用，還可用于治療白血病、粒細胞缺乏癥、再生障礙貧血等多種疾病。6腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)腫瘤壞死因子這一名稱是因最初發(fā)現(xiàn)時觀察到它的抗腫瘤活性而命名的。隨著人們對TNF的深入研究，該名稱已不再能反映其全部的生物活性。TNF除具有抗腫瘤活性外對多種正常細胞還具有廣泛的免疫生物學(xué)活性，如炎癥活性，促凝血活性，促進細胞因子分泌，免疫調(diào)節(jié)作用，抗病毒、細菌和真菌作用，熱原質(zhì)作用以及參與骨質(zhì)重吸收

17、等。目前TNF經(jīng)鑒定有3種1)主要由激活巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-；(2)主要由激活淋巴細胞產(chǎn)生的INF-，又名淋巴細胞毒素(LT)；(3)由NK細胞產(chǎn)生的細胞毒因子TNF-。(NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細胞，具有廣泛的生物學(xué)功能，位于機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線。NK細胞作為天然免疫的主要效應(yīng)細胞，在感染性疾病的防治、腫瘤的生物治療以及骨髓移植中發(fā)揮了不可替代的作用。皮膚黏膜組織是機體的重要免疫器官之一，是阻擋病原微生物入侵的天然屏障，而NK細胞是這一屏障的主要效應(yīng)細胞之一。 ) 1984年基因重組TNF獲得成功后，1985年即獲美國FDA批準(zhǔn)用于臨床，在治療某些感性腫瘤上收到較好的

18、效果。此外，TNF在臨床診斷上也有一定意義。但天然TNF有一定毒副反應(yīng)。國內(nèi)1989年首次報道組建高表達人TNF工程菌株。并通過鑒定，重在研究TNF的衍生物，以提高比活性和減少毒副作用。目前，用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制TNF突變體主要有：(1)將原型TNF分子中第80、90和92位的Ile、Lys和Asn分別被Ser、His和Val置換，經(jīng)E. coli表達產(chǎn)生rhTNFD3a產(chǎn)物，毒性比原型TNF低11倍左右；(2)將TNFN末端的第2位Arg換成Lys，在及E. coli中表達TNFK2產(chǎn)物，對某些人腫瘤細胞株表現(xiàn)出比TNP高出幾十倍到幾百倍的抑制活性，且毒性稍低；(3)在TNF分子的末端缺7個

19、氨基酸，8、9、10和C端157位氨基酸分別被ArgLysArg和Phe取代，在E. coli 中表達TNF mutant protein產(chǎn)物，生物活性比天然的提高10倍，可降低用藥量，減低其毒副作用，且產(chǎn)物以可溶形式存在，易于純化。7心鈉素(Atrial natriurctic factor ANF或ANP)心鈉素是心房利鈉因子。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于一種多肽，故又稱心房肽(ANP)。心鈉素具有較強的利鈉、利尿、擴張血管和降低血壓的作用。在調(diào)節(jié)體液容量和濃度、控制血壓、維持體液平衡方面起著重要作用、可作為降血壓藥和利尿藥，用于治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫和氣喘等疾病。人的心鈉素基

20、因(化學(xué)合成)已先后在大腸桿菌、酵母菌和哺乳動物細胞中得到表達。1986年VlasukIs等已將化學(xué)合成的人心鈉素24肽(128-151)基因成功地在酵母細胞中獲得表達。而且表達產(chǎn)物可分泌到培養(yǎng)液中。我國也已成功地將人心鈉素基因克隆到酵母分泌性表達載體中，并獲得高效表達， 95以上的產(chǎn)物被分泌到培養(yǎng)液中。 8重組乙肝疫苗重組乙肝疫苗是以基因工程技術(shù)研制的第2代乙型肝炎（HB）疫苗，已獲得了突破性和實用性進展，是基因工程疫苗中最成功的例子。目前，乙肝病毒(HBV)基因在真核細胞中表達已出現(xiàn)了4條途徑：(1)將HBV的S、S2或S1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母，用重組酵母生產(chǎn)HB疫苗“如深圳康泰生物制品公

21、司)；(2)將S、 S2或S1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞（中華地鼠卵巢細胞），大量培養(yǎng)重組動物細胞株生產(chǎn)HB疫苗（如我國長春生物制品研究所）；(3)將S、 S2或S1基因插入病毒DNA必需區(qū)，轉(zhuǎn)染中華地鼠卵巢細胞,大量培養(yǎng)動物細胞株生產(chǎn)HB疫苗；(4)將S、 S2或S1基因插入昆蟲核多角體病毒DNA非必需區(qū)，轉(zhuǎn)染家蠶和碟蛹生產(chǎn)HB疫苗。 美國的重組酵母疫苗于1986年正式投放市場，法國的哺乳動物細胞疫苗于1984年投入批量生產(chǎn)?，F(xiàn)在國內(nèi)正在開展第3代HB疫苗的研究如美、法和德國都已研制出人工合成的前S多肽疫苗、具有很強的免疫原性。此外、由化學(xué)合成HBsAg多肽與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)形式復(fù)合蛋白分

22、子制成的疫苗，既可預(yù)防乙肝，又能預(yù)防破傷風(fēng)。我國基因工程藥物研究和開發(fā) 主要是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，開發(fā)化學(xué)合成法難以生產(chǎn)的醫(yī)藥產(chǎn)品，如肝炎、腫瘤、傳染病和心腦血管疾病預(yù)防、診斷和治療的生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品。第三章 基因工程制藥思考題（1） 1、基因工程技術(shù)的概念是什么？ 2、基因工程制物的優(yōu)越性有哪些？ 3、基因工程的發(fā)展給人類疾病治療帶來影響有哪些？ 4、利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要哪幾類？二、基因的一般特性：二、基因的一般特性：基因可自我復(fù)制基因可自我復(fù)制基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因可突變。基因可突變。基因按功能分為：基因按功能分為：結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因調(diào)控基因調(diào)控基因基因工程藥物 基

23、因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。主要是醫(yī)主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽類：用活性蛋白和多肽類：（1 1）免疫性蛋白免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體，如各種抗原和單克隆抗體（2 2）細胞因子細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、表，如各種干擾素、白細胞介素、表皮生長因子、凝血因子等皮生長因子、凝血因子等（3 3）激素激素，如胰島素、生長激素、心鈉素等，如胰島素、生長激素、心鈉素等（4 4）酶類酶類，如尿

24、激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化物物 歧化酶等歧化酶等基因工程藥物 基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。主要是醫(yī)主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽類：用活性蛋白和多肽類：（1 1）免疫性蛋白免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體，如各種抗原和單克隆抗體（2 2）細胞因子細胞因子，如各種干擾素、白細胞介素、表，如各種干擾素、白細胞介素、表皮生長因子、凝血因子等皮生長因子、凝血因子等（3 3）激素激素，如胰島素、生長激素、心鈉素等，如胰島素、生長激素、心鈉素等（4 4）酶類酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化物物 歧化酶等歧化酶等 人胰島素的基因工程生產(chǎn)一般采用兩種方式：一是分別在大腸桿菌中合成A鏈和B鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。美國EIi Lilly公司采用該法