AgilentHPLC儀器組成及基本操作步驟

1、1 Agilent 1200 HPLC Agilent 1200 HPLC 儀器組成及基本操作步驟 Agilent 1200 HPLC Agilent 1200 HPLC 結(jié)構(gòu)圖 高效液相色譜法（HPLCHPLC：是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，以高壓輸 送流動(dòng)相，采用高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器， 發(fā)展而成的現(xiàn)代液相 色譜分析方法。它具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測(cè)靈 敏度高、操作白動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。 一. 溶劑瓶裝置 溶劑 使用棕色玻璃瓶會(huì)避免藻類(lèi)的生長(zhǎng)； 所用的水為重蒸水；溶劑選用色 譜純，使用前要用 0.22 v m0.22 v m 的過(guò)濾膜過(guò)濾；使用新鮮配制的流動(dòng)相， 特別

2、是水溶劑或鹽緩沖液，建議不超過(guò)兩天；避免溶劑瓶暴露在直射 陽(yáng)光1.溶劑（流動(dòng)相）一 真空脫氣機(jī) 3、手動(dòng)進(jìn)樣器 4、柱溫箱 2,輸液系統(tǒng) （四元泵） 2 下。 避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑： 堿金屬鹵化物及其酸溶液 （如：碘化鋰、氯化鉀等） ；高濃度無(wú)機(jī)酸， 如硝酸、硫酸；可能含有過(guò)氧化物的色譜醇酬 （如 THFTHF 二氧六環(huán)、 二丙基乙酬）。這些在 使用前必須用干燥氧化鋁過(guò)濾除去過(guò)氧化物； 含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液（如 EDTAEDTA 乙二胺四乙酸）；四氯化碳與 2 2- -異丙醇 或四氫味喃的混合液。 二. 在線(xiàn)脫氣裝置3 溶用RK箱 輸出毛蜩官至自動(dòng)謎樣器(G1312-67306) MCCV

3、 波紋康褊管的掖頭【5。死”4孫，再訂購(gòu)包裝，5浦 在線(xiàn)脫氣機(jī)工作原理 4 總覽（只癡四個(gè)梆通道中的一個(gè)） 真空箱 四元泵真空脫氣機(jī)由一個(gè)四通道（有四個(gè)管狀塑料膜）真空箱和一個(gè) 真空泵構(gòu)成。打開(kāi)真空脫氣機(jī)的電源開(kāi)關(guān)后，控制電路即開(kāi)啟真空泵， 真空泵運(yùn)行使真空箱內(nèi)產(chǎn)生部分真空。 真空度由壓力傳感測(cè)定，根據(jù) 傳感器信號(hào)，真空脫氣機(jī)通過(guò)運(yùn)行或關(guān)閉真空泵來(lái)維持真空度。 溶劑瓶中的溶劑在 LCLC 泵的抽動(dòng)下流過(guò)真空箱內(nèi)的特殊管狀塑料膜。 當(dāng)溶劑經(jīng)過(guò)真空管時(shí)，溶劑中溶解的氣體將滲透過(guò)塑料膜進(jìn)入真空 箱，到達(dá)真空脫氣機(jī)出口時(shí)，溶劑幾乎被完全脫氣而不含有任何氣體。 三. Agilent 1200 Agile

4、nt 1200 四元泵5 6 四鬲蹣 1 2 3 4 當(dāng)鹽溶液和有機(jī)溶劑混合時(shí)，鹽溶液可能與有機(jī)溶劑完全混溶， 而不 會(huì)出現(xiàn)沉淀。但是在梯度閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來(lái)。 通常，閥的 A A 通道用于水相/ /鹽溶液，而泵的 B B 通道用于有機(jī)溶劑。 如果使用的是這樣的配置，鹽將落回到鹽溶液中，并被溶解。 A: A: 水相 B:B:甲醇 C:C:乙臘 D:D:緩沖鹽 當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增 加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力。所以開(kāi)泵前一定要打開(kāi) sealseal- -wash,wash,用 10% 10% 異丙醇沖洗泵。 10% 10%異丙醇有助于降低水的表面

5、張力， 并有抑菌作用。不要用其它 溶劑代替。 7 四. 手動(dòng)進(jìn)樣器 先使閥處于裝樣(load )load )位置，用微量注射器將試樣注入貯樣管 (sampling loop (sampling loop )。進(jìn)樣時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯至進(jìn)樣(injection injection )位置， 貯樣管內(nèi)的試樣由流動(dòng)相帶入色譜柱。定量環(huán)為 20 v l20 v l。 五. 檢測(cè)器 按其適用范圍檢測(cè)器可分為通用型和專(zhuān)屬型兩大類(lèi)。 專(zhuān)屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)， 如紫外檢測(cè)器和熒光 檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。 通用型檢測(cè)器檢測(cè)的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，如示差折光和蒸發(fā) 光散射檢測(cè)

6、器。 紫外檢測(cè)器的工作原理是朗伯-比爾定律。紫外檢測(cè)器包括固定波長(zhǎng)、 可變波長(zhǎng)和光電二極管陣列檢測(cè)器。 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器一般采用免燈為光源，能夠按需要選擇組分的最 大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，從而提高靈敏度。 基本操作步驟 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測(cè)樣品的性質(zhì)，選擇相應(yīng)的分析 色譜柱； 配制分析的樣品和流動(dòng)相，選用色譜純流動(dòng)相或用 0.220.22訴訴m m 的過(guò) 濾膜過(guò)濾(進(jìn)口甲醇和乙臘不用過(guò)濾) ； 檢驗(yàn)儀器和計(jì)算機(jī)的電源線(xiàn)，數(shù)據(jù)線(xiàn)是否連接完好。 開(kāi)機(jī) 8 將所用的通路小心放入試劑瓶中（防止濾頭破裂），色譜柱按流速 的方向裝好，要擰緊并在柱頭和柱尾的下面墊上濾紙； 先打開(kāi)總電源的開(kāi)關(guān)，然后

7、打開(kāi)計(jì)算機(jī)的電源，待計(jì)算機(jī)運(yùn)行穩(wěn)定； 從上到下依次打開(kāi)脫氣機(jī)、泵、柱溫箱、檢測(cè)器的電源開(kāi)關(guān)； 待儀器白檢完成后，雙擊桌面上的“聯(lián)機(jī)”圖標(biāo)，打開(kāi)工作站（如 圖一所示） 設(shè)定參數(shù) 更改樣品信息：?jiǎn)螕暨\(yùn)行控制下的樣品信息彈出對(duì)話(huà)框 （如圖二所 示），更改操作者姓名、子目錄和所存儲(chǔ)的文件的文件名。 設(shè)置試劑瓶的填充量：?jiǎn)螕艚缑嫔系脑噭┢康膱D標(biāo)，設(shè)定溶劑的體 積（如圖三所示） 啟動(dòng)各個(gè)模塊：點(diǎn)擊啟動(dòng)泵、柱溫箱的快捷鍵，啟動(dòng)泵和柱溫箱， 等柱壓穩(wěn)定后才能啟動(dòng)檢測(cè)器。 設(shè)置柱溫箱： 在圖標(biāo)上點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，單擊設(shè)置柱溫箱出現(xiàn)對(duì)話(huà) 框（如圖四所示）然后設(shè)置實(shí)驗(yàn)所需要的柱溫。 脫氣：?jiǎn)螕舯玫膱D標(biāo)，點(diǎn)擊設(shè)置泵，彈出

8、對(duì)話(huà)框（如圖五所示） 先將閥旋開(kāi) 1212 圈，設(shè)置流速為 5ml/min,5ml/min,含量為 100100 睬次 purgepurge 各 個(gè)管路，一般先purgepurge水相再purgepurge有機(jī)相。每個(gè)管路purge 35purge 35分 鐘，purgepurge時(shí)一定要認(rèn)真檢查濾頭和管路中是否殘留有氣泡。 Purge Purge 完后，將流速設(shè)為 1ml/min1ml/min，并迅速將閥擰緊，用 100100 掰醇或乙臘沖 洗柱子，待柱壓穩(wěn)定后可以打開(kāi)檢測(cè)器。 單擊檢測(cè)器的圖標(biāo)，然后單擊設(shè)置 VWVW 晡號(hào)可出現(xiàn)對(duì)話(huà)框（如圖六 所9 示），可以設(shè)置所用的波長(zhǎng)。 注意：若流動(dòng)

9、相里有緩沖鹽就先用 100100 用醇或乙臘沖洗柱子半個(gè)小 時(shí)然后還要用 9595 咖和 5%5%屯甲醇或純乙臘沖洗柱子最少 1515 分鐘，然 后再用你所需要的流動(dòng)相比例走基線(xiàn)?；€(xiàn)穩(wěn)定后就可以進(jìn)樣分析。 在對(duì)話(huà)框中可以設(shè)置梯度洗脫（如圖八所示） 數(shù)據(jù)分析：雙擊桌面上的脫機(jī)圖標(biāo)，出現(xiàn)對(duì)話(huà)框然后單擊文件夾圖 標(biāo)（如圖九所示） 關(guān)機(jī) 樣品分析完后，用 100100 用醇或乙臘沖洗柱子最少半個(gè)小時(shí)。如果 流動(dòng)相里有緩沖鹽要先用 9595 咖和 5%5%屯甲醇或乙臘沖柱子半個(gè)小時(shí)， 然后再用 100%?100%?醇或乙臘沖洗柱子半個(gè)小時(shí)。 沖洗完后，將流速設(shè)為 0ml/min,0ml/min,將水相

10、中的濾頭放入有機(jī)相中， 將閥打開(kāi)，設(shè)流速設(shè)為 5ml/min5ml/min，含量為 100% purge100% purge 水相的管路。 若用的有緩沖鹽，要先將濾頭放入純水中 purge35purge35 分鐘，然后再放 入有機(jī)相中 purge35purge35 分鐘。各個(gè)管路 purgepurge 完后，將閥擰緊。 依次關(guān)閉界面上的泵、柱溫箱和檢測(cè)器。關(guān)閉聯(lián)機(jī)和脫機(jī)的界面， 然后關(guān)閉計(jì)算機(jī)。 從下到上依次關(guān)閉儀器的各個(gè)模塊的電源開(kāi)關(guān)，然后換下色譜柱。 關(guān)閉總電源。 注意事項(xiàng)： 配制流動(dòng)相所用的水要為重蒸水，新鮮配制，使用前要用 0.220.22訴訴 m m的過(guò)濾膜過(guò)濾。要用色譜級(jí)的有機(jī)試劑

11、。 10 有機(jī)系和水系的濾膜要分開(kāi)，有機(jī)系的濾膜也可以過(guò)濾水系，但是 水系的濾膜不能過(guò)濾有機(jī)系，有機(jī)相會(huì)腐蝕濾膜。 供試品一定要用 0.45 v m0.45 v m 的濾頭過(guò)濾，否則會(huì)引起進(jìn)樣閥阻塞。 泵啟動(dòng)前要開(kāi)啟 sealseal- -washwash，用 1010 得丙醇沖洗泵。設(shè)流速為一分 鐘三滴，若流動(dòng)相中含有緩沖鹽，設(shè)流速為三秒鐘一滴。 流動(dòng)相使用前要進(jìn)行脫氣，脫氣前一定要將閥打開(kāi) 1212 圈，purgepurge 時(shí)要仔細(xì)檢查濾頭和管路中是否有氣泡，脫氣完后將流速設(shè)為 1ml/min1ml/min 后，迅速將閥擰緊（不要擰的過(guò)緊）。注意觀察壓力，若壓 力大于 10bar,10b

12、ar,要與管理員聯(lián)系。 一定要將柱頭和柱尾擰緊，防止漏液。如果漏液，將流速設(shè)為 0ml/min0ml/min，然后再將柱子裝好。用 100100 用醇或乙臘沖洗柱子時(shí)，注意 觀察柱壓如果柱壓過(guò)大，要將流速設(shè)為 0ml/min ,0ml/min ,然后檢查原因，防 止將臟東西流入檢測(cè)器。 為保護(hù)檢測(cè)器，等柱壓穩(wěn)定后再開(kāi)啟檢測(cè)器。 進(jìn)樣品前要修改樣品信息，否則會(huì)將上一個(gè)樣品的信息覆蓋。 進(jìn)樣前后都要用甲醇清洗進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥。 樣品分析完后，為保護(hù)濾頭，要將水相中的管路放入有機(jī)相中 purge35 purge35 分鐘。 為什么溶劑和樣品要過(guò)濾？ 溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作

13、用， 消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小 顆11 粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損， 同時(shí)也 會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。 為什么 HPL3HPL3 緩沖鹽時(shí)要加在線(xiàn) SealSeal- -washwash 選項(xiàng)？ HPLCHPLC 用緩沖鹽時(shí)，由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象， 析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬，它附著在藍(lán)寶石活塞桿上，隨著藍(lán)寶石活 塞桿的往復(fù)運(yùn)動(dòng)，容易產(chǎn)生劃痕，并磨損密封墊，造成漏液等故障現(xiàn) 象。在線(xiàn)SealSeal- -washwash 選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。 緩沖 鹽的濃度在0.1mol0.1mol 或大