第十一章 紅霉素的生產(chǎn)

1、u 了解紅霉素的藥效作用、應(yīng)用范圍及其它有關(guān)工藝技術(shù)及技術(shù)改造方向；u 熟悉紅霉素的理化性質(zhì)、重要化學(xué)反應(yīng)；u 掌握紅霉素的生產(chǎn)原理、生產(chǎn)工藝過程及生產(chǎn)控制要點。第一節(jié) 概述u認(rèn)識紅霉素認(rèn)識紅霉素 紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。這類抗生素結(jié)構(gòu)具有聚烯酮衍生的，被一內(nèi)酯鍵閉合的大環(huán)內(nèi)酯骨架，并通過羥基以糖苷鍵聯(lián)結(jié)13個罕有的中性或堿性糖?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如下： 紅霉素A是白色或類白色的結(jié)晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、氯仿、酯類（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。在水中的溶解度為2mg/ml（25左右），它隨著溫度的升高而減少。在室溫和pH 68的條件下，其溶液相當(dāng)穩(wěn)定，溫度升高穩(wěn)定性下降。

2、紅霉素熔點為135140（游離堿水合物），190193（無水游離堿）。且具有旋光性和紫外吸收峰。紅霉素堿能和有機酸或無機酸類結(jié)合成鹽，其鹽類易溶于水。 紅霉素是廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌作用強，臨床上主要用于呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。第二節(jié) 生產(chǎn)原理 紅霉素是由紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythrea）發(fā)酵產(chǎn)生的。該菌以前稱為紅霉素鏈霉菌（Streptomyces erythreus）。生產(chǎn)上一般是將其孢子懸液接入種子罐，種子擴大培養(yǎng)2次后移入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后，再經(jīng)溶媒萃取進(jìn)行分離純化，最后經(jīng)濃縮結(jié)晶干燥后得成品。

3、紅霉素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)紅霉素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)u菌體的生長發(fā)育菌體的生長發(fā)育 紅色糖多孢菌在合成培養(yǎng)基上生長的菌落由淡黃色變?yōu)槲ⅫS色，氣生菌絲為白色，孢子呈不緊密的螺旋形，約35圈，孢子呈球狀。u菌種的培養(yǎng)菌種的培養(yǎng) 紅色糖多孢菌一般經(jīng)斜面孢子、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)后移入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。紅霉素的生物合成紅霉素的生物合成u合成機理合成機理 紅霉素的生源主要來自葡萄糖和氨基酸，其生物合成過程是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，下面是紅霉素生物合成的最后幾步：丙酸鹽經(jīng)過多步反應(yīng)形成中間體6-脫氧紅霉內(nèi)酯B；在C-6上進(jìn)行羥基化反應(yīng)形成紅霉內(nèi)酯B；L-紅霉糖轉(zhuǎn)至內(nèi)酯環(huán)的C-3位羥基上形成3-L-碳霉糖基紅霉內(nèi)酯B；D-紅

4、霉氨基糖結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)移至C-5羥基后得到紅霉素D；紅霉素D在C-12羥基化可得紅霉素C，紅霉素C再甲基化則得紅霉素A；紅霉素D的紅霉糖部分甲基化可形成紅霉素B 。 紅霉素生物合成過程中紅霉素反饋調(diào)節(jié)生物合成最后一步酶甲基化酶的活性，而丙酸激酶和丙酰-CoA羧化酶的活化與紅霉素合成有關(guān)。發(fā)酵發(fā)酵 紅霉素發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵過程，在發(fā)酵過程中，需不斷通入無菌空氣并攪拌，以維持一定的罐壓和溶氧。 發(fā)酵過程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液還原糖量、pH值、溶氧量及發(fā)酵液粘度等，以便紅色糖多孢菌能夠大量合成紅霉素并排至胞外。生產(chǎn)中還要加入消泡劑以控制泡沫。 在發(fā)酵期間每隔一定時間也要取樣進(jìn)行分析、鏡檢及無菌試驗，

5、檢測生產(chǎn)狀況，分析或控制相關(guān)參數(shù)。發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾 發(fā)酵液中除含有約0.8%的紅霉素外，絕大部分是菌絲體、蛋白質(zhì)、色素、油等雜質(zhì)，給提取和精制帶來困難。尤以蛋白質(zhì)和油等的存在，在溶媒萃取時將產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。 一般采用硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，促使菌絲結(jié)團(tuán)加快濾速。加入去乳化劑（十二烷基苯磺酸鈉，DS），由于硫酸鋅呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而破壞，要用NaOH調(diào)節(jié)pH值。由于鋅離子的毒性給濾渣處理帶來一定困難，改用堿式氯化鋁有利于處理濾渣。 經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵液便可進(jìn)行過濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質(zhì)。紅霉素發(fā)酵液過濾采用板框過濾機。 紅霉素的提取紅霉素的提取 紅霉素分子結(jié)構(gòu)中

6、有一個二甲基氨基官能團(tuán)，是一個弱堿，pKa=8.6，在酸性條件下與某些酸會形成鹽，如紅霉素乳酸鹽。純紅霉素堿在水中溶解度較小，并隨溫度升高而減小，在55時溶解度最小，當(dāng)pH10.0時紅霉素基本以游離堿的形式存在，能溶于乙酸丁酯中，當(dāng)pH6.0時，紅霉素以鹽的形式存在，其在水中的溶解度隨pH降低而迅速增大。 提取采用在乙酸丁酯及在水溶液（乙酸緩沖液）中反復(fù)萃取。紅霉素的精制紅霉素的精制 在乙酸丁酯結(jié)晶液中加入丙酮，低溫下放置使紅霉素結(jié)晶析出。一般加液操作溫度要低。因為紅霉素在丙酮溶液中隨溫度升高溶解度降低，加液溫度高結(jié)晶會形成塊狀物，難于過濾。結(jié)晶產(chǎn)生后，適當(dāng)提高溫度減少母液中紅霉素含量，使結(jié)晶

7、完全。結(jié)晶經(jīng)分離并洗滌后可除去紅霉素C，提高成品質(zhì)量，最后得紅霉素堿。 乳酸鹽沉淀法是依據(jù)紅霉素分子中堿性糖的二甲氨基可與乳酸成鹽，從萃取液中沉淀析出。生產(chǎn)上是在高濃度乙酸丁酯萃取液中用無水硫酸鈉除水，過濾除去硫酸鈉后，在攪拌下將乳酸加入到乙酸丁酯萃取液中析出紅霉素乳酸鹽，分離掉溶媒，將此鹽溶解于丙酮水溶液中，加氨水堿化轉(zhuǎn)化為紅霉素堿，洗滌，真空干燥后得成品。 第三節(jié) 紅霉素生產(chǎn)工藝過程u紅霉素的發(fā)酵工藝過程紅霉素的發(fā)酵工藝過程工藝流程工藝流程工藝控制工藝控制種子罐 種子罐分一級和二級（亦稱繁殖罐），接種量為10%。發(fā)酵控制 發(fā)酵培養(yǎng)基的控制（最適的碳源是蔗糖，其次是葡萄糖、淀粉；氮源以黃豆餅

8、粉為主，其次是花生餅粉、玉米漿、蠶蛹粉和硫酸銨，中間補料有花生餅粉、蛋白胨、酵母粉和氨水等；發(fā)酵過程加入丙醇（或丙酸、丙酸鈉）作為前體物質(zhì)可以明顯提高紅霉素A的產(chǎn)量）、發(fā)酵培養(yǎng)的控制（ 加糖控制、補氮及加前體、 pH值控制、溫度控制、溶解氧的控制、溶液黏度控制、泡沫的控制、污染雜菌的控制、發(fā)酵液質(zhì)量控制）等。u紅霉素的提取和精制工藝過程紅霉素的提取和精制工藝過程 工藝流程工藝流程 （1）溶媒法提取和精制的工藝流程 （2）溶媒萃取結(jié)合紅霉素乳酸鹽沉淀的工藝流程工藝控制溶媒萃取法的工藝控制要點 pH值 發(fā)酵液預(yù)處理時用NaOH將pH值調(diào)至7.88.2，控制加料速度并開攪拌，防止局部過酸。溶媒法進(jìn)行

9、提取和精制時堿化時pH高些，對提取有利，但不能過高，否則會引起紅霉素的堿性破壞，同時堿性高對乳濁液的穩(wěn)定性有利，使乳化嚴(yán)重。pH過低，對萃取也不利，影響收率。pH值控制在100.5范圍較適宜。酸化時控制pH在4.90.3范圍，pH再偏高對紅霉素穩(wěn)定性有好處，但萃取則不完全，影響收率；pH再偏低時，對萃取有利，但對紅霉素穩(wěn)定性不利，易發(fā)生酸性水解。當(dāng)紅霉素轉(zhuǎn)入緩沖液后，要立即用10%NaOH調(diào)至pH78之間，且加入適當(dāng)丁酯。溶媒法用乙酸磷酸氫二鈉緩沖液作二級逆流提取，當(dāng)紅霉素轉(zhuǎn)入緩沖液后，用pH9.810.2的乙酸丁酯作三級萃取。 溫度 由于紅霉素在水中的溶解度以55時為最小，因此，當(dāng)紅霉素從水

10、相轉(zhuǎn)入溶媒時可適當(dāng)加溫至3032。從緩沖液轉(zhuǎn)入第二次丁酯時，一般也加熱到3840。加溫的目的在于減少紅霉素在水相中的溶解度，有利于萃取。萃取液最后在-5、10%丙酮水溶液中結(jié)晶。真空干燥，控制干燥溫度在7080。第四節(jié) 其他工藝技術(shù)及技術(shù)改造方向u大孔吸附樹脂提取工藝大孔吸附樹脂提取工藝 大孔吸附樹脂CAD-40或SIP-1300等作為吸附劑，通過動態(tài)吸附，從發(fā)酵濾液中吸附紅霉素。用40熱水快速洗滌樹脂，流速0.1v/v/min，用量1：1，再用等體積pH值等于10的氨水溶液通過。然后用2%氨水混合丁酯進(jìn)行解吸，流速0.01v/v/min二柱串聯(lián)解吸。u離子交換樹脂的提取工藝離子交換樹脂的提取工藝 采用陽離子交換樹脂來提取紅霉素。用交聯(lián)度（一般為15.5DVB%）磺酸型陽離子交換樹脂（聚苯乙烯系）是有效的。一般先將樹酯轉(zhuǎn)為Na+型或NH4+型。在接近中性條件（pH5.57.0）下進(jìn)行吸附。再用堿性的醇溶液（0.25mol/L氨的90%甲醇溶液）自樹脂上解吸紅霉素，解吸前先用水、30%及60%甲醇溶液進(jìn)行洗滌。u開發(fā)新產(chǎn)品開發(fā)新產(chǎn)品 紅霉素的半合衍生物：羅紅霉素、阿齊霉素、克拉霉素和地紅霉素等。這類半合成紅霉素具有耐酸、高效、長效等特點，可減少給藥劑量和次數(shù)，所以不良反應(yīng)發(fā)生率亦比紅霉素低。 將紅霉素制備成紅霉素