淺析細菌內(nèi)毒素檢測方法及常見問題

1、淺析細菌內(nèi)毒素檢測方法及常見淺析細菌內(nèi)毒素檢測方法及常見問題問題 內(nèi)內(nèi) 容容v細菌內(nèi)毒素簡介細菌內(nèi)毒素簡介v細菌內(nèi)毒素檢測方法細菌內(nèi)毒素檢測方法v常見問題及解決方案常見問題及解決方案一、細一、細 菌菌 內(nèi)內(nèi) 毒毒 素素 簡簡 介介v主要內(nèi)容主要內(nèi)容 來源來源 特性特性 與熱源的關系與熱源的關系 在藥檢中應用在藥檢中應用v主要來源主要來源 主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當細菌死亡或自主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當細菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素，其化學成分主要是脂多糖，溶后便會釋放出內(nèi)毒素，其化學成分主要是脂多糖，這是一種大分子物質，分子量約為這是一種大分子物質，分子量約為106，其粒徑約，其粒徑約在

2、在1 5納米納米 。 細菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中細菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中含內(nèi)毒素的量為含內(nèi)毒素的量為1至至100EU/ml。v主要特性主要特性（實驗器材處理方法）（實驗器材處理方法）1.1.耐熱性耐熱性 一般在一般在100加熱加熱1小時無影響，小時無影響，120加熱加熱4小時能破壞小時能破壞98，180200干熱干熱2小時或小時或250干熱半小時干熱半小時才能完全破壞。才能完全破壞。 故故：注射劑的一般滅菌條件是不能破壞內(nèi)毒素的。注射劑的一般滅菌條件是不能破壞內(nèi)毒素的。2.2.不耐酸堿性不耐酸堿性 內(nèi)毒素可被強酸、強堿和氧化劑破壞。內(nèi)毒素可被強酸、強堿和氧化劑破壞

3、。 故：玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡故：玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡v主要特性主要特性（實驗器材處理方法）（實驗器材處理方法）3.3.水溶性與不揮發(fā)性水溶性與不揮發(fā)性 熱原能溶于水，本身不具揮發(fā)性，但能隨水蒸熱原能溶于水，本身不具揮發(fā)性，但能隨水蒸氣霧滴夾帶入蒸餾水中，造成污染。氣霧滴夾帶入蒸餾水中，造成污染。 故：不可用濕熱滅菌法處理實驗器具故：不可用濕熱滅菌法處理實驗器具v主要特性主要特性（去除內(nèi)毒素方法）（去除內(nèi)毒素方法）4.4.濾過性濾過性 原體積很小，約在原體積很小，約在1 15 nm5 nm之間，故能通過除之間，故能通過除菌濾器而進入濾液中，但不能通過石棉濾板，也不菌濾器而進入濾液中，但不能通

4、過石棉濾板，也不能通過半透膜。能通過半透膜。5.5.吸附性吸附性 能被活性炭吸附劑吸附。內(nèi)毒素在溶液中帶有能被活性炭吸附劑吸附。內(nèi)毒素在溶液中帶有一定的電荷，因而可被某些離子交換介質吸附。一定的電荷，因而可被某些離子交換介質吸附。v熱原熱原=內(nèi)毒素內(nèi)毒素 ？ 熱原指熱原指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復合物微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復合物等使人體發(fā)熱的物質，等使人體發(fā)熱的物質，不僅僅是細菌內(nèi)毒素。不僅僅是細菌內(nèi)毒素。 但在藥檢的范疇，細菌內(nèi)毒素是主要的熱但在藥檢的范疇，細菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒原物質，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原素就是控制熱原。v熱

5、原檢查方法簡介熱原檢查方法簡介 中國藥典中國藥典熱原檢查方法是采用家兔升溫法進熱原檢查方法是采用家兔升溫法進行檢查。行檢查。 將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。熱原檢查法v與熱源對比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢與熱源對比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢v方便、快捷、經(jīng)濟；方便、快捷、經(jīng)濟；v重現(xiàn)性好、靈敏度高；重現(xiàn)性好、靈敏度高；v避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測定的誤差；避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測定的誤差； 近年來已經(jīng)普遍采用

6、細菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱源近年來已經(jīng)普遍采用細菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱源法法v在藥檢中的應用在藥檢中的應用 細菌內(nèi)毒素檢查作為控制藥品質量的一種方法，細菌內(nèi)毒素檢查作為控制藥品質量的一種方法，已經(jīng)廣泛的被世界各國藥典收載。已經(jīng)廣泛的被世界各國藥典收載。v成品檢查成品檢查藥品安全性檢查之一藥品安全性檢查之一 v半成品（生產(chǎn)過程）檢查半成品（生產(chǎn)過程）檢查事前質控手段，避事前質控手段，避免造成藥品成批報廢免造成藥品成批報廢二、二、細菌內(nèi)毒素檢測方法細菌內(nèi)毒素檢測方法v中國藥典中國藥典批準使用方法批準使用方法：v供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。但當測供試品檢測時，可使用其中任

7、何一種方法進行試驗。但當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。v本節(jié)將著重介紹凝膠法的操作與有關原理。本節(jié)將著重介紹凝膠法的操作與有關原理。測定 方法凝膠法凝膠法 光度測定法光度測定法 濁度法濁度法 顯色基質法顯色基質法 鱟試劑與內(nèi)毒素反應機理內(nèi)毒素內(nèi)毒素C因子因子活化的活化的C因子因子凝膠凝膠B因子因子 凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶活化的活化的B因子因子凝固蛋白原凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應名詞解釋名詞解釋1鱟及鱟試劑鱟及鱟試劑鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物

8、 門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經(jīng)裂解液和機鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經(jīng)裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，能與極微量的細菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應，反應能與極微量的細菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應，反應的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關，是體的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。名詞解釋名詞解釋2國家標準品及工作標準品國家標準品及工作標準品國家標準品：國家標準品： （單位：（單位

9、：EU/mlEU/ml） 自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價；效價；工作標準品：工作標準品： 經(jīng)國家標準品稀釋用于試驗中鱟試劑靈敏度符經(jīng)國家標準品稀釋用于試驗中鱟試劑靈敏度符復核、干擾試驗及各種陽性對照；復核、干擾試驗及各種陽性對照；名詞解釋名詞解釋3細菌內(nèi)毒素檢查用水細菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法：凝膠法： 內(nèi)毒素含量小于內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml的滅菌注射用水；的滅菌注射用水； 故：滅菌注射用水故：滅菌注射用水細菌內(nèi)毒素檢查用水

10、細菌內(nèi)毒素檢查用水 光度法：光度法： 內(nèi)毒素含量應小于內(nèi)毒素含量應小于0.005EU/ml0.005EU/ml；細菌內(nèi)毒素檢測之凝膠法細菌內(nèi)毒素檢測之凝膠法v實驗程序實驗程序1、試驗準備：試劑、儀器及用具、試驗準備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復核、鱟試劑靈敏度復核4、供試品干擾試驗（新藥或新方法）、供試品干擾試驗（新藥或新方法）5、供試品細菌內(nèi)毒素凝膠法檢測、供試品細菌內(nèi)毒素凝膠法檢測v實驗材料及用具實驗材料及用具1、儀器、儀器名稱名稱要求要求天平天平感量感量0.1mg0.1mg以下以下電熱干燥箱電熱干燥箱300300

11、恒溫水浴箱恒溫水浴箱37371 1 水銀或酒精溫度計水銀或酒精溫度計100 100 1 1 漩渦混合器漩渦混合器/ /計時器計時器60min60min1min1min2、器具、器具器具分類器具分類器具名稱器具名稱反應試管反應試管玻璃試管（外徑玻璃試管（外徑1075mm）、試管架、）、試管架、小三角瓶或磨口瓶小三角瓶或磨口瓶移液器具移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其他其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆封口膜、記號筆v試劑試劑1 1、鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準文號、鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準文號

12、2 2、內(nèi)毒素工作標準品、內(nèi)毒素工作標準品3 3、內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素檢查用水4 4、7575乙醇乙醇v常用英文縮寫常用英文縮寫B(tài)ETBET：細菌內(nèi)毒素檢查：細菌內(nèi)毒素檢查 BETBET水水：細菌內(nèi)毒素檢查用水：細菌內(nèi)毒素檢查用水 MVDMVD：供試品最大有效稀釋倍數(shù)：供試品最大有效稀釋倍數(shù) NCNC：陰性對照：陰性對照MVCMVC：供試品最低有效濃度：供試品最低有效濃度 PCPC：陽性對照：陽性對照：鱟試劑靈敏度：鱟試劑靈敏度 L L：供試品細菌內(nèi)毒素限值：供試品細菌內(nèi)毒素限值v靈敏度復核試驗：每批鱟試劑用于檢測前都必須進行靈敏度靈敏度復核試驗：每批鱟試劑用于檢測前都必須進行靈敏度復核。復

13、核。目的目的是為了是為了對試劑、檢測者的操作、環(huán)境條件、水平對試劑、檢測者的操作、環(huán)境條件、水平條件進行驗證。以證實操作正常無誤，準確可靠和結果可信。條件進行驗證。以證實操作正常無誤，準確可靠和結果可信。 試驗舉例：內(nèi)毒素工作標準品為試驗舉例：內(nèi)毒素工作標準品為90EU/支；支； 待測鱟試劑靈敏度待測鱟試劑靈敏度0.25EU/ml0.25EU/ml。1 1、制備內(nèi)毒素標準溶液：取工作標準品一支，輕彈瓶壁使粉、制備內(nèi)毒素標準溶液：取工作標準品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用7575酒精擦拭后啟開，酒精擦拭后啟開，加加1mlBET1mlBET水

14、溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min15min后進行稀釋，步驟如下后進行稀釋，步驟如下( (箭頭下方為加入箭頭下方為加入BETBET水量水量) )：90EU/ml90EU/ml10EU/ml10EU/ml1EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.0625EU/ml0.2ml0.2ml1.6ml1.6ml0.2ml0.2ml1.8ml1.8ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1

15、ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml水水水水溶解后的標準品溶解后的標準品水水水水水水水水9090EU/mlEU/ml1010EU/mlEU/ml1 1EU/mlEU/ml0.50.5EU/mlEU/ml0.250.25EU/mlEU/ml0.1250.125EU/mlEU/ml0.06250.0625EU/mlEU/ml（2 ）（ ）（0.5 ） （0.25 ）2 2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml0.1ml裝量，則取裝量，則取1818支，每支加入支，每支加入0.1mlBET0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大

16、于水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml0.1ml，則取若干支，則取若干支，按標示量加入按標示量加入 BETBET水溶解，再取水溶解，再取0.1ml0.1ml分裝于標準玻璃試管分裝于標準玻璃試管（10mm10mm75mm75mm），將試管按如下形狀排列。），將試管按如下形狀排列。3 3、加樣：每列每支加入相應濃度的內(nèi)毒素標準品溶液各、加樣：每列每支加入相應濃度的內(nèi)毒素標準品溶液各0.1ml0.1ml，第五列加入第五列加入BETBET水水0.1ml0.1ml。1 1222 23 30.50.54 40.250.25BETBET水水22220.50.50.50.50.250.250.250.25v反應

17、及結果判斷：加樣結束后用封口膜封口，輕振動反應及結果判斷：加樣結束后用封口膜封口，輕振動混勻，置混勻，置37 水浴中保溫水浴中保溫60602min2min，將每管拿出緩，將每管拿出緩緩倒轉緩倒轉180180，凝膠不變形為，凝膠不變形為“”，凝膠不能保持，凝膠不能保持完整為完整為“”。 當當2.02.0四支管都為陽性，四支管都為陽性，0.25四支管都為陰性時，四支管都為陰性時，試驗成立，按下面底公式計算復核的靈敏度試驗成立，按下面底公式計算復核的靈敏度c c ： c clglg-1-1(X/4)(X/4)（X:X:反應終點濃度的對數(shù)值。）反應終點濃度的對數(shù)值。） 當當0. 5c c 2.02.0

18、時，鱟試劑靈敏度復核合格，檢測時，鱟試劑靈敏度復核合格，檢測時仍以標示靈敏度時仍以標示靈敏度為準。為準。左側管旋轉左側管旋轉180凝膠不能保持完整為陰性，記為凝膠不能保持完整為陰性，記為“”；右側管旋轉；右側管旋轉180180凝膠不變形為陽性，記為凝膠不變形為陽性，記為“”。舉例：舉例：設待復核的鱟試劑標示靈敏度設待復核的鱟試劑標示靈敏度為為0.125EU/ml0.125EU/ml:平行平行管數(shù)管數(shù)內(nèi)毒素標準溶液濃度（內(nèi)毒素標準溶液濃度（EU/mlEU/ml）NCNC反應終反應終點濃度點濃度C CX X(lgC)(lgC)0.250.250.1250.1250.060.060.030.031+

19、-0.06-1.22-1.222+-0.125-0.903-0.9033+-/0.125-0.903-0.9034+-/0.125-0.903-0.903clg-1(X/4) lg-1（-1.22）（）（-0.903）（）（ -1.22 ）（）（ -1.22 ）/4 0.104（EU/ml） cc在在0. 50. 52.02.0范圍內(nèi)，符合規(guī)定。范圍內(nèi)，符合規(guī)定。v方法學驗證方法學驗證供試品干擾預試驗供試品干擾預試驗目的：目的： 確證產(chǎn)品對方法是否存在干擾（抑制或增強），確證產(chǎn)品對方法是否存在干擾（抑制或增強），得到供試品的最大不干擾濃度或最小不干擾稀釋倍得到供試品的最大不干擾濃度或最小不干擾

20、稀釋倍數(shù)，為正式干擾實驗提供依據(jù)。數(shù)，為正式干擾實驗提供依據(jù)。影響因素：影響因素： 新藥檢查方法建立；新藥檢查方法建立； 鱟試劑批號或來源的改變；鱟試劑批號或來源的改變； 檢品生產(chǎn)工藝，配方，成分的改變；檢品生產(chǎn)工藝，配方，成分的改變； 檢品關鍵成分來源的改變；檢品關鍵成分來源的改變； 方法學驗證方法學驗證供試品干擾預試驗供試品干擾預試驗v供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計算 MVDCL/ L:供試品的內(nèi)毒素限值； C：供試品溶液的濃度； 當L以 EU/ml表示時，C為1ml/ml;當L以EU/mg或EU/u表示時，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當L以EU/ml表示時，C的值不是樣品的濃度，

21、就是1)。 方法學驗證方法學驗證供試品干擾預試驗供試品干擾預試驗v內(nèi)毒素限值內(nèi)毒素限值(L)的確定的確定 藥典附錄有相應計算公式，即當今世界各國普遍采藥典附錄有相應計算公式，即當今世界各國普遍采用的細菌內(nèi)毒素計算公式，即：用的細菌內(nèi)毒素計算公式，即：L=K/M，式中，式中K為為按規(guī)定給藥途徑，人每公斤體重每小時可以接受的按規(guī)定給藥途徑，人每公斤體重每小時可以接受的不產(chǎn)生任何不良反應的細菌內(nèi)毒素劑量（亦稱致熱不產(chǎn)生任何不良反應的細菌內(nèi)毒素劑量（亦稱致熱閾），它基本上是一固定值，藥典上對每一給藥途閾），它基本上是一固定值，藥典上對每一給藥途徑的徑的K值都有具體的規(guī)定。值都有具體的規(guī)定。M為按規(guī)定的

22、給藥途徑，為按規(guī)定的給藥途徑，人每公斤體重每小時給藥的最大劑量。這一個值的人每公斤體重每小時給藥的最大劑量。這一個值的確定實際上才是計算限值的關鍵。確定實際上才是計算限值的關鍵。方法學驗證方法學驗證供試品干擾預試驗供試品干擾預試驗（1）原則上一般根據(jù)藥品使用說明書或國家藥典委）原則上一般根據(jù)藥品使用說明書或國家藥典委員會編制的員會編制的臨床用藥須知臨床用藥須知來確定最大劑量。來確定最大劑量。 如如兒童用藥劑量大于成人用藥劑量，則以兒童劑量為兒童用藥劑量大于成人用藥劑量，則以兒童劑量為準。準。（2）為保證安全用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療）為保證安全用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥

23、用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品藥心血管疾病等重癥用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品藥品，可根據(jù)計算值適當調(diào)整，嚴格至計算限值的品，可根據(jù)計算值適當調(diào)整，嚴格至計算限值的1/2或或1/3。v方法學驗證方法學驗證供試品干擾試驗供試品干擾試驗 目的：目的：驗證預干擾中確定的濃度或倍數(shù)下的供驗證預干擾中確定的濃度或倍數(shù)下的供 試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應有無干擾作用。試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應有無干擾作用。 試驗方法：試驗方法：須選擇兩家以上的鱟試劑進行試驗須選擇兩家以上的鱟試劑進行試驗 編號編號內(nèi)毒素濃度內(nèi)毒素濃度/ /配制配制內(nèi)毒素的溶內(nèi)毒素的溶液液稀釋稀釋用液用液稀釋稀釋倍數(shù)倍數(shù)所含內(nèi)毒所含內(nèi)毒素的濃度素

24、的濃度平行平行管數(shù)管數(shù)A A無無/ /供試品溶液供試品溶液2 2B B2/2/供試品溶液供試品溶液供試品溶液供試品溶液1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4C C2/2/檢查用水檢查用水檢查用水檢查用水1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D無無/ /檢查用水檢查用水2 2v方法學驗證方法學驗證供試品干擾試驗供試品干擾試驗結果判定：結果判定： 如果有供試品和無供試品測得的鱟試劑靈敏度（如果有供試品和無供試品測得的鱟試劑靈敏度（c）均在均在0.5-2.0范圍內(nèi)時，則認為供試品在該濃度下不干范圍內(nèi)時，則

25、認為供試品在該濃度下不干擾試驗，否則需要對供試品做適當處理。擾試驗，否則需要對供試品做適當處理。 干擾的排除：干擾的排除： 對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋；對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋； 選擇靈敏度更高的鱟試劑；選擇靈敏度更高的鱟試劑； 其他適宜的方法其他適宜的方法 如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。 v供試品細菌內(nèi)毒素凝膠法檢測供試品細菌內(nèi)毒素凝膠法檢測 檢測方法：檢測方法： 結果結果 判定判定 陰性陰性 陽性陽性 陽性陽性 陰性陰性編號編號內(nèi)毒素濃度內(nèi)毒素濃度/ /配制內(nèi)毒素的配制內(nèi)毒素的溶液溶液平行管數(shù)平行管數(shù) A A無無/ /供試品溶液供試品溶液

26、2 2 B B2/2/供試品溶液供試品溶液2 2 C C2/2/檢查用水檢查用水2 2 D D無無/ /檢查用水檢查用水2 2 注：注：A 無干擾濃度供試品溶液；無干擾濃度供試品溶液；B 供試品陽性對照；供試品陽性對照；C 陽性對照；陽性對照；D 陰性對照。陰性對照。三、常見問題及解決方案三、常見問題及解決方案1、實驗前未復核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度、實驗前未復核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度 鱟試劑靈敏度的改變或質量不符合要求，會影響實鱟試劑靈敏度的改變或質量不符合要求，會影響實驗結果，因此實驗前應復核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏驗結果，因此實驗前應復核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏2、實驗器具的潔凈度不符合要求、實驗器具的潔凈度不符

27、合要求 一般用硫酸清潔液浸泡，用自來水沖洗干凈，再用新一般用硫酸清潔液浸泡，用自來水沖洗干凈，再用新鮮蒸餾水沖洗三道，并干熱（鮮蒸餾水沖洗三道，并干熱（250）恒溫）恒溫1h即可。即可。實驗用的玻璃器具必須嚴格無菌無熱原，建議不要使實驗用的玻璃器具必須嚴格無菌無熱原，建議不要使用一次性塑料制品。用一次性塑料制品。3、實驗條件達不到要求、實驗條件達不到要求 實驗室要求潔凈，無塵?？諝饬魍?，若是空調(diào)室，實驗室要求潔凈，無塵埃空氣流通，若是空調(diào)室，應備有一臺超凈工作臺。應備有一臺超凈工作臺。 4、溫度不符合要求、溫度不符合要求 實驗室溫度為實驗室溫度為252較好，恒溫水浴箱溫度為較好，恒溫水浴箱溫度

28、為371為宜為宜。5、忽視樣品本身干擾、忽視樣品本身干擾 供試品若經(jīng)干擾試驗證實存在干擾因素，可采供試品若經(jīng)干擾試驗證實存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個重要用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個重要原則是原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。 (1).(1).供試品稀釋法供試品稀釋法 MVD=CL / MVD=CL / 鱟試劑靈敏度鱟試劑靈敏度()()越高越高( (數(shù)值越小數(shù)值越小) )，供試品的稀，供試品的稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)越大，干擾越小。越大，干擾越小。 (2). (2).物理方法物理方法 如加熱法如加熱法( (血液制品血液制品) )、冷析法、冷析法( (甘露醇甘露醇 ) ) (3). (3).化學方法化學方法 如調(diào)節(jié)如調(diào)節(jié)PHPH值值( (奎諾酮類奎諾酮類) )、調(diào)節(jié)金屬離子、調(diào)節(jié)金屬離子( (血液保血液保養(yǎng)液、養(yǎng)液、FDP)FDP) (4). (4).生物方法生物方法 如抗增液的使用，阻斷如抗增液的使用，阻斷G G因子反應，防止假陽性；因子反應，防止假陽性； (5).