賽潤(rùn)ELISAclassic支原體肺炎IgGIgMIgA

1、賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體 IgG/IgM/IgA目錄1. 用途2. 診斷意義3. 賽潤(rùn) ELISA classic- 檢測(cè)原理4. 試劑盒組成5. 檢測(cè)所需物質(zhì)，試劑盒未提供6. 儲(chǔ)存和穩(wěn)定性7. 賽潤(rùn) ELISA classic 的檢驗(yàn)步驟7.1 注意事項(xiàng)7.2 樣品準(zhǔn)備和儲(chǔ)存7.3 試劑盒反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備7.4 檢測(cè)程序概要7.5 檢測(cè)過(guò)程8. 檢測(cè)結(jié)果評(píng)估8.1 4PL 單點(diǎn)定量法8.2 檢驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)定量）8.3 計(jì)算賽潤(rùn) ELISA classic 肺炎支原體 IgG/IgM/IgA8.4 檢測(cè)結(jié)果分析9. 性能特性9.1 重復(fù)性9.2 敏感性和特異性0.警告10.1

2、 警告和安全措施10.2 廢料處理11.參考文獻(xiàn)賽潤(rùn) ELISA classic 肺炎支原體 IgG/IgM/lgA酶聯(lián)免疫法測(cè)定人體抗體（IgG/IgM/lgA ）-只限用于體外診斷-IgG試劑盒（定量）編號(hào)ESR127GIgM試劑盒（定量）編號(hào)ESR127MIgA試劑盒（定量）編號(hào)ESR127A檢測(cè)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：BEP 2000, BEP III, DSX,手動(dòng)操作1. 用途賽潤(rùn)ELISA classic肺炎支原體IgG/IgM/lgA 用于定性和/或定量檢測(cè)人血清或血 漿內(nèi)肺炎支原體。抗肺炎支原體病毒IgG , IgM和IgA聯(lián)合使用會(huì)有助于對(duì)肺炎支原體感染做岀確切的診斷。IgA-Elisa

3、的使用特別在診斷再感染時(shí)，對(duì)于IgG和IgM診斷是一個(gè)重要的補(bǔ)充。2. 診斷意義支原體肺炎病毒的感染會(huì)導(dǎo)致許多有可能引起嚴(yán)重并發(fā)癥的呼吸系統(tǒng)疾病。在這些疾 病中首先值得一提的是初級(jí)非典型肺炎，咽炎以及呼吸道支氣管炎。在美國(guó)支原體肺 炎病毒的感染要占每年門(mén)診肺炎的 20%。肺炎支原體感染的臨床癥狀具備多樣性并且與其它原因引起的呼吸道感染（如呼 吸道合抱病毒，流感-感染等）很難區(qū)別。肺炎支原體可使氣管、支氣管以及細(xì)支 氣管上皮細(xì)胞增生。感染后10-20天之后才岀現(xiàn)一些非特異癥狀，如頭疼、發(fā)燒、無(wú)痰干咳等。在感染期限間還可能會(huì)發(fā)展成間質(zhì)性肺炎。大齡兒童和小齡成年人 門(mén)診肺炎的15-20%來(lái)自肺炎支原

4、體病毒。在兒童中觀察到病毒性感染（如麻疹） 或細(xì)菌性感染（鏈球菌肺炎）后的肺炎支原體的重復(fù)感染。小齡兒童（5歲）中肺炎支原體感染經(jīng)常無(wú)癥狀而消失或只導(dǎo)致輕度呼吸道感 染。由于感染后沒(méi)有足夠的免疫力存在，會(huì)岀現(xiàn)需要長(zhǎng)時(shí)間康復(fù)期并不斷加重的 再感染（多次）。正因?yàn)檫@些不同癥狀的存在，診斷不能僅靠臨床現(xiàn)象進(jìn)行，而 需要進(jìn)一步地確診（如病原體證明，血清學(xué)等），以便進(jìn)行相應(yīng)的治療。肺炎支原體感染的病理學(xué)以支原體與呼吸道上皮細(xì)胞粘結(jié)，以在宿主細(xì)胞上滑動(dòng) 和宿主高細(xì)胞免疫活性為基礎(chǔ)。（細(xì)菌凝集素和人宿主細(xì)胞的同源性很有可能可 以預(yù)防凝集，降低細(xì)胞免疫活性進(jìn)而組織上皮細(xì)增生）。肺炎支原體感染的免疫反應(yīng)可以描述

5、如下：IgM- 抗體是在發(fā)生特殊癥狀后約 7 天之后可以被檢測(cè)到。在首發(fā)癥狀后的10-30天后可以檢測(cè)到最大的 IgM- 抗體濃度。 12-26 周后 IgM- 抗體的滴定度將降低到無(wú) 法檢測(cè)的程度。IgM- 抗體最頻繁地出現(xiàn)于初期感染階段，因此，在較年輕患者中能測(cè)到高濃度的IgM- 抗體，而在大齡患者（很有可能再感染了的）中幾乎測(cè)不出或測(cè)到極微乎其 微的 IgM- 抗體。正由于其常有的再感染， IgM- 抗體會(huì)被削弱并降低到檢測(cè)不到的 水平。在剛剛被感染的情況下， IgA- 檢測(cè)的結(jié)果清楚、敏感。大量的抗體形成于出現(xiàn)感 染癥狀的 3 周內(nèi)，從出現(xiàn)感染癥狀第 5 周起 IgA 和 IgM 抗體

6、濃度下降。 IgA- 抗體 濃度下降的速度比 IgM- 抗體的濃度更快。肺炎支原體感染IgG-抗體的岀現(xiàn)要比IgA-抗體和IgM-抗體晚。它在發(fā)病第5周后 才達(dá)到最大濃度。因?yàn)?IgG- 抗體反應(yīng)是肺炎支原體感染最可靠，也是最晚期的反 應(yīng)，所以?xún)H有 IgG 檢測(cè)通常被視作確診的標(biāo)志。急性感染很少會(huì)有無(wú) IgA- 抗體和 IgM- 抗體產(chǎn)生的情況。 在這種情況下， 診斷應(yīng)更 依賴(lài)于 IgG- 抗體的檢測(cè)。CFT 試驗(yàn)是應(yīng)用最為廣泛的診斷肺炎支原體 -感染的血清學(xué)方法。 它最致命的缺點(diǎn) 就是由于全細(xì)胞抗原制備中LPS-分子交叉反應(yīng)導(dǎo)致的低異性。顯而易見(jiàn)地，具有較高特異性的結(jié)果來(lái)源于使用特制抗原的

7、Elisa 方法（如 P1 肺炎支原體的粘結(jié)） 。3. 賽潤(rùn)ELISA classic-檢驗(yàn)原理用抗原 包被微量板孔，制成 固相載體 。加患者血清到板孔中，其所含的抗體特異 性地與固相載體中存在的抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。除去多余物質(zhì)后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的 IgG 、IgA 和 IgM 抗體，使之與上述免疫復(fù)合物反應(yīng)。洗板，除 去多余的結(jié)合物，加入底物（對(duì)硝基苯磷酸鹽）。該反應(yīng)產(chǎn)生有顏色產(chǎn)物，顏色 強(qiáng)度與特異性抗體含量成正比。4.試劑盒的組成試驗(yàn)成分IgG試劑盒IgM試劑盒 IgA試劑盒 數(shù)量/劑量微孔條（此微孔條可掰開(kāi)單獨(dú)使用，每條有8孔，共96孔，已經(jīng)包被了抗原）1個(gè)微孔條框架包被的抗原

8、為滅活抗原121212標(biāo)準(zhǔn)血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸鹽緩沖液；抗 HIV 抗體、抗乙肝病毒（HBV ）表面抗原和抗丙 肝病毒（HCV ）抗體均為陰性；防腐劑：0.1%疊氮化鈉染色劑：紫紅色02X 2毫升2 X 2 毫升2X 2毫升陰性質(zhì)控血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸鹽緩沖液；抗 HIV 抗體、抗乙肝病毒（HBV ）表面抗原和抗丙 肝病毒（HCV ）抗體均為陰性；防腐劑：0.1%疊氮化鈉 染色劑：里沙明綠 V1X 2毫升1 X 2 毫升1X 2毫升酶標(biāo)記的抗人IgG, IgA, IgM （立即可用） 羊抗人IgG, IgA, IgM （多克?。?，堿性磷酸 脂酶，以蛋白穩(wěn)化溶

9、液加以穩(wěn)化。防腐劑：0.02%甲基異噻唑啉酮0.02%溴化硝基二堊烷13毫升13毫升13毫升濃縮洗液（可稀釋至 1000毫升） 氯化鈉，含吐溫 20和30mM Tris 防腐劑：0.1%疊氮化鈉1 X 33.3毫升1 X 33.3毫升1 X 33.3毫升稀釋緩沖液磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含蛋白和吐溫20防腐劑：0.1%疊氮化鈉0.01克/升的溴酚藍(lán)鈉鹽2 X 50 毫升2X 50毫升2X 50 毫升終止液1.2N氫氧化鈉15毫升15毫升15毫升底物（立即可用）鄰硝基苯磷酸鹽，不含其它溶劑的緩沖液 防腐劑：濃度小于 0.1%的疊氮化鈉（瓶子未蓋好底物可能會(huì)輕微變黃，但不會(huì) 影響其質(zhì)量）13毫升13毫升1

10、3毫升帶有標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和評(píng)估表的質(zhì)量控制認(rèn)證文件（抗體以IU/毫升或U/毫升計(jì)量）1115. 其它檢測(cè)所需物質(zhì) -普通實(shí)驗(yàn)室所需的儀器裝置-IgM檢測(cè)：賽潤(rùn)類(lèi)風(fēng)濕因子Rf吸附劑（產(chǎn)品編號(hào) Z100/5ml和Z200/20ml ）-分光光度計(jì)，波長(zhǎng)405納米，建議參考波長(zhǎng)范圍 620納米-690納米（例如650 納米）-37 C溫箱- 濕盒-蒸餾水。6. 儲(chǔ)存及穩(wěn)定性試劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性微孔條（抗原）開(kāi)封后放在2-8 C裝有干 燥劑的密封鋁箔袋中。有效期內(nèi)質(zhì)控血清/標(biāo)準(zhǔn)血清開(kāi)封后保存于 2-8 °Co有效期內(nèi)；18個(gè)月酶標(biāo)記抗體立即可用的溶液于 2-8 C 儲(chǔ)存。避免污染（使用無(wú)菌針 頭）。有效

11、期內(nèi)24個(gè)月稀釋緩沖液開(kāi)啟后于2-8 C儲(chǔ)存。有絮狀時(shí)丟掉未開(kāi)圭寸18個(gè)月有效期內(nèi)36個(gè)月洗滌液濃縮液開(kāi)封后保存于2-8 Co工作液在2-8 Co 工作液在室溫下。盛過(guò)工作液的瓶子應(yīng)按常 規(guī)方法清洗，并丟棄混濁 溶液。有效期內(nèi)2星期1星期底物2-8 C儲(chǔ)存，避光。 避免污染（使用無(wú)菌針 頭）。當(dāng)溶液變?yōu)辄S色時(shí) 應(yīng)予以丟棄（水作空白， 吸光度大于0.2時(shí)）。有效期內(nèi)24個(gè)月終止液開(kāi)封后保存于室溫下。有效期內(nèi)7. 賽潤(rùn)ELISA classic的檢驗(yàn)步驟 7.1注意事項(xiàng)只有全部使用賽潤(rùn) ELISA classic試劑才能保證檢測(cè)效果，因?yàn)樗性噭┒际怯?關(guān)聯(lián)的，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。尤其是標(biāo)準(zhǔn)

12、血清，對(duì)照血清以及酶標(biāo)記物， 必須使用試劑盒配備的，不要使用其它批號(hào)產(chǎn)品。稀釋緩沖液，洗液，終止液和 底物溶液可用于所有賽潤(rùn)ELISA classic試劑盒。ELISA classic試劑盒內(nèi)所有試劑均必須正確地存放。應(yīng)在未開(kāi)封的情況下，保存于2-8 C，并在有效期（見(jiàn)標(biāo)簽說(shuō)明）內(nèi)使用。詳細(xì)的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存資料在“6.儲(chǔ)存及穩(wěn)定性”內(nèi)將加以詳每一種試劑都是經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)以保證最佳的檢測(cè)結(jié)果。這些試劑如果未經(jīng)規(guī)定被稀釋 或改動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的敏感度的降低。在儲(chǔ)存及孵育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā) 和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致岀現(xiàn)錯(cuò)誤的 結(jié)果。應(yīng)

13、按照規(guī)定刻度截?cái)辔⒖讞l。當(dāng)裝微孔條的鋁袋開(kāi)封后，應(yīng)及時(shí)用夾子夾緊，否 則不可使用。開(kāi)始試驗(yàn)前，將所有試劑置于室溫。從試劑管中吸取試劑的時(shí)候，應(yīng)注意使用無(wú)菌技術(shù)以防污染。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，吸加酶結(jié)合物時(shí)，吸嘴應(yīng)確保不接觸或噴灑于小孔的外面，注意不要蓋錯(cuò)瓶蓋或試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性依賴(lài)于充分混合試劑。使用前振蕩裝有對(duì)照血清的小管和所有稀釋過(guò)的溶液（例如使用混合小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本/對(duì)照血清，酶結(jié)合物或底物時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大， 將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。只有嚴(yán)格遵守賽潤(rùn)ELISA clas

14、sic試劑的試驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。如果實(shí)驗(yàn)中未嚴(yán)格遵守質(zhì)量控制認(rèn)證文件上的有效性特異準(zhǔn)則，則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果：應(yīng)該小心進(jìn)行洗滌。洗滌步驟應(yīng)遵守相關(guān)洗滌器（平底孔，孔直徑7毫米，深10.9 毫米）指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行。重要的是所有的孔內(nèi)均應(yīng)加入相同體積的洗滌緩沖液。洗 滌結(jié)束時(shí)，應(yīng)將微孔板倒扣于紙巾上并輕輕敲打，以確保所有孔內(nèi)均無(wú)洗滌緩沖 液。避免產(chǎn)生泡沫！如果使用自動(dòng)洗板機(jī)，注意正確操作。7.2樣本準(zhǔn)備儲(chǔ)存雖然，在檢驗(yàn)中不會(huì)產(chǎn)生副影響，但為避免干擾結(jié)果，應(yīng)保留使用高血脂的、溶 血的或污染的血清。樣品不應(yīng)加熱滅活。721樣品稀釋開(kāi)始試驗(yàn)前，患者的待測(cè)樣品必須以稀釋緩沖液稀

15、釋如下（V1+V2）：V1+V2=1+100加10微升患者待測(cè)樣品于1000微升稀釋緩沖液稀釋后及加入微孔板前，樣品必須充分混合類(lèi)風(fēng)濕因子干擾類(lèi)風(fēng)濕因子抗體是IgM的自體抗體，可與IgM免疫復(fù)合物結(jié)合。非特異性IgM抗體（風(fēng)濕因子）的存在將導(dǎo)致 IgM檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果。另外，也存在弱結(jié)合的 病原體特異性IgM抗體被強(qiáng)結(jié)合的IgG抗體取代的可能性。在這種情況下，IgM的檢測(cè)將得到 假陰性的結(jié)果。因此，在進(jìn)行IgM檢測(cè)前應(yīng)用類(lèi)風(fēng)濕因子吸附劑對(duì)血清作預(yù)處理。（賽潤(rùn)類(lèi)風(fēng)濕因子吸附劑，產(chǎn)品編號(hào)Z100 （5ml/25樣品）及Z200（20ml/100 樣品）。樣品儲(chǔ)存密封的患者樣品可在冰箱中2-8 C保

16、存7天。W -20 C可保存更久。避免樣品反復(fù)凍融已稀釋的樣品可在2-8 C保存一星期。7.3試劑盒反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備7.3.1 微孔條微孔條置于一框架內(nèi)，并與干燥劑一同封于鋁袋之中。應(yīng)將不需要的微孔條取下 并重新放入鋁袋。將袋口折疊 2-3次，并以?shī)A子夾緊，確保鋁袋的密封性。7.3.2 對(duì)照血清/標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)血清立即可用，不必進(jìn)一步稀釋。對(duì)于每次試驗(yàn)和每批檢測(cè)體系，無(wú)論使用的微量板數(shù)目的多少，均應(yīng)包括陰性陽(yáng) 性對(duì)照孔。界定對(duì)照應(yīng)作雙份。如果是定量試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)血清也做雙份。不要用RF吸附劑處理對(duì)照血清！7.3.3 抗人IgG, IgA 或IgM抗體，用 AP標(biāo)記（即用）禁止將不同試劑盒的酶標(biāo)抗

17、體混合使用。同一試劑盒才能達(dá)到最佳檢測(cè)效果。7.3.4 洗液以1 : 30稀釋濃縮洗滌緩沖液（V1 ）至體積V2。例如：濃縮緩沖液（V1）終體積（V2）33.3毫升1000毫升1毫升30毫升7.3.5 樣品的稀釋緩沖液（即用）7.3.6 底物（即用）試驗(yàn)時(shí)戴手套以避免污染。必須以無(wú)菌針頭吸取底物溶液7.3.7 終止液（即用）7.4 檢測(cè)程序概要肺炎支原體IgG / IgM/ IgA 定量進(jìn)行IgM檢測(cè)時(shí)先吸除RF因子,樣品稀釋液（患者樣本）1+100將稀釋的樣本，和立即可用的對(duì)照血清/標(biāo)準(zhǔn)血清，加到微量孔內(nèi)（100微升）孵育60分鐘/37C濕盒中洗滌加入已稀釋的酶標(biāo)記抗體溶液（100微升）再孵

18、育30分鐘/37C濕盒中洗滌加入底物溶液（100微升）再孵育30分鐘/37C濕盒中加入終止液（100微升）在405納米處讀消光系數(shù)7.5檢測(cè)過(guò)程 將檢測(cè)所需數(shù)目的微孔條放到微孔板框上并準(zhǔn)備好一張標(biāo)簽。在微量孔內(nèi)分別加入100微升的已稀釋樣本對(duì)照血清。留一個(gè)孔為底物空白使用，例如：定量的IgG / IgM /IgA微量孔孔A1孔B1孔C1孔D1孔E1底物空白 陰性對(duì)照 標(biāo)準(zhǔn)血清 標(biāo)準(zhǔn)血清 標(biāo)本17.5.3將樣品于濕盒內(nèi)37C（ ±C）孵育60分鐘（±5分鐘）。7.5.4孵育后以洗液緩沖液洗滌板孔（使用自動(dòng)洗板機(jī)或手工洗板）：-吸去或甩去洗液-每孔內(nèi)加入300微升洗液-吸去或甩

19、去洗液-重復(fù)洗滌過(guò)程3次（共4次?。?將微孔板翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)在紙巾上拍打，使微孔中不再含有液體7.5.5加入酶標(biāo)記抗體。于相應(yīng)孔內(nèi)（底物空白除外）加入100微升IgG / IgM / IgA 酶標(biāo)記抗體7.5.6濕盒內(nèi)37C（ ±C）孵育30分鐘（±1分鐘）*。7.5.7孵育后，以洗液清洗板孔（洗滌見(jiàn)上）7.5.8加入底物于每孔內(nèi)加入100微升底物溶液（包括底物空白孔）7.5.9濕盒內(nèi)37C（ ±TC）孵育30分鐘（±1分鐘）*。7.5.10 終止反應(yīng)每孔內(nèi)加入100微升終止液，輕微振蕩微孔板以混合溶液。7.5.11 讀取消光度以底物空白為空白對(duì)照液， 60分

20、鐘內(nèi)讀取405納米的OD值，建議參考 波長(zhǎng)范圍為 620納米-690納米（例如 650納米）。*請(qǐng)您注意：在特殊的工作環(huán)境下有必要對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。8.檢測(cè)結(jié)果評(píng)估賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgG /IgM /IgA （定量）8.1用4PL方法，單點(diǎn)定量通過(guò)應(yīng)用一非線(xiàn)性方程，消光信號(hào)數(shù)值的最佳分配得以保證，該方程可在不對(duì) OD值作任何改動(dòng)的情況下調(diào)整S型曲線(xiàn)。賽潤(rùn)ELISA classic抗體滴度的確定是通過(guò) 邏輯對(duì)數(shù)模型（4PL, 4參數(shù)）計(jì)算得岀 的，此模型可精確適用于相關(guān)曲線(xiàn)。它是基于以下公式：ODD-A(C-ln con c.)e參數(shù)A,B,C,D分別代表曲線(xiàn)的準(zhǔn)確形

21、狀:1.下端漸近線(xiàn)參數(shù)A2.曲線(xiàn)斜率參數(shù)B3.轉(zhuǎn)折點(diǎn)參數(shù)C4.上端漸近線(xiàn)參數(shù)D標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)由在德國(guó)維爾茨堡的德國(guó)維潤(rùn)賽潤(rùn)研發(fā)有限公司試驗(yàn)多次研制所得。使 用者無(wú)需花費(fèi)大量的時(shí)間和使用昂貴的儀器來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。每一個(gè)試劑盒內(nèi)均帶有一特異標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和一特異求值表圖以衡量抗體活度。如有 需要也可取得相關(guān)的評(píng)估軟件。為了校正正常試驗(yàn)偏差和建立試驗(yàn)對(duì)照，每輪試驗(yàn)均需使用標(biāo)準(zhǔn)血清。對(duì)于此種 對(duì)照血清，有效范圍參考值是由廠商的質(zhì)量控制決定的。在此范圍內(nèi)，可保證抗 體滴的正確計(jì)量。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)血清不必是一陽(yáng)性對(duì)照，所以在某些ELISA試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)血清數(shù)值可能近于0或負(fù)值。8.2有效性標(biāo)準(zhǔn)- 底物空白的0D值必須0.2-陰

22、性對(duì)照必須為負(fù)值-賽潤(rùn)ELISA classic定量試驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)血清的平均OD值必須在有效范圍內(nèi)，此范圍在試劑盒的特異性質(zhì)量控制認(rèn)證書(shū)上給定（減去底物空白之后！）-賽潤(rùn)ELISA classic定量試驗(yàn)：陽(yáng)性對(duì)照的平均OD值必須在有效范圍內(nèi)，此范圍在試劑盒的特異性質(zhì)量控制認(rèn)證書(shū)上給定（減去底物空白之后！）如果未遵守以上標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)無(wú)效且必須重做。8.3賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgG / IgM /IgA的定量計(jì)算非自動(dòng)評(píng)估每個(gè)試劑盒內(nèi)均備有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和一個(gè)評(píng)估表，因而每一個(gè)OD值就可得到一個(gè)抗體活性值。標(biāo)準(zhǔn)血清的參考值和有效范圍會(huì)在求值表格（質(zhì)量控制認(rèn)證）中 給定。所有的OD值

23、在求值前必須先減去空白A1方法1:定性評(píng)估為確定臨界值范圍， 請(qǐng)將已測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn) OD平均值與質(zhì)量控制證書(shū)上給岀的數(shù)據(jù)相 乘（見(jiàn)專(zhuān)用公式），例如：OD = 0.502 x MW（STD）臨界值上限OD = 0.352 x MW（STD）臨界值下限如果得到的標(biāo)準(zhǔn)血清的平均消光度值是0.64,那么臨界值的范圍即為0.225-0.321。方法2:用評(píng)估表格來(lái)確定抗體活性級(jí)別1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)血清兩個(gè) 0D值的平均值，并檢查其是否在給定的有效范圍內(nèi)。2. 然后，將所得結(jié)果轉(zhuǎn)入“標(biāo)準(zhǔn)血清0D范圍”欄，在此進(jìn)行求值。3. 已測(cè)得的患者樣品值通過(guò)讀取“IU / ml或U / ml”來(lái)求得相應(yīng)的抗體活性。例如：標(biāo)準(zhǔn)

24、血清0D范圍0.57-0.610.62-0.65IU / ml 或 U / ml其它<0.06<0.07<50.07-0.125-100.13-0.2211-190.23-0.3220-300.33-0.4031-40例如：測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)血清平均消光度值為0.64。對(duì)其而言，結(jié)果的確定與OD值范圍0.62-0.65 欄相關(guān)。由患者的OD值0.25可得岀其單位范圍為20-30。方法3:利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行抗體活性的連續(xù)求值。通過(guò)將當(dāng)前患者樣品測(cè)量結(jié)果乘以校正系數(shù)F，可糾正所謂的“測(cè)定間差異“（不同測(cè)量時(shí)間及不同試驗(yàn)室引起的差異）。此系數(shù)的計(jì)算如下所示：標(biāo)準(zhǔn)血清 OD參考值F 標(biāo)準(zhǔn)血清當(dāng)

25、前測(cè)量 OD值此步驟對(duì)于糾正由特異標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取得的當(dāng)前試驗(yàn)水平是必需的。首先，日間測(cè)定差異可通過(guò)計(jì)算（校正系數(shù)F）得以糾正：1. 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)血清兩 OD值的平均數(shù)，檢查此平均數(shù)是否在給定的有效范圍之內(nèi)。2. 計(jì)算校正因子F :給定的參考數(shù)值除以標(biāo)準(zhǔn)血清消光度值平均數(shù)。F=標(biāo)準(zhǔn)血清參考消光度值/標(biāo)準(zhǔn)血清消光度值平均數(shù)。3. 將患者樣品所有測(cè)得值均乘以校正因子“F”U / ml 或4. 此時(shí)便可通過(guò)修正后的數(shù)值以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得抗體活性IU / ml賽潤(rùn)ELISA classic肺炎支原體IgG （成人）：陽(yáng)性結(jié)果：> 30U / ml不確定性結(jié)果：20-30U / ml陰性結(jié)果：< 20U

26、/ ml賽潤(rùn)ELISA classic肺炎支原體IgG （兒童）：陽(yáng)性結(jié)果：> 15U / ml不確定性結(jié)果：10-15U / ml陰性結(jié)果：< 10U / ml賽潤(rùn)ELISA classic肺炎支原體 IgM :陽(yáng)性結(jié)果：> 17U / ml不確定性結(jié)果：13-17U / ml陰性結(jié)果：< 13U / ml賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgA :陽(yáng)性結(jié)果：> 14U / ml不確定性結(jié)果：10-14U / ml陰性結(jié)果：< 10U / ml如樣品所得結(jié)果為不確定，應(yīng)于1-2星期后再次復(fù)查832通過(guò)SERION easy base 4PL軟件/

27、SERION 自動(dòng)評(píng)估軟件進(jìn)行自動(dòng)評(píng)估。輸入四個(gè)參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)血清參考值之后，聯(lián)機(jī)軟件就會(huì)計(jì)算出抗體活性。如果標(biāo)準(zhǔn)血清的消光值超岀有效范圍，SERION easy base 4PL軟件就會(huì)顯示如下信息：“標(biāo)準(zhǔn)已超岀允許范圍”和/或“標(biāo)準(zhǔn)差異大于 20%SERION評(píng)估軟件只用英語(yǔ)顯示:,Sta ndard values out of ran ges in follow ing groups: Group 1-24. Stan dard valuediffer more than 20% in following groups: Group 1-24. ” 以下組樣品標(biāo)準(zhǔn)值超岀范圍：組1-24。以下

28、組樣品標(biāo)準(zhǔn)值差異大于20% :組1-24?！? 在這種情況下，此輪試驗(yàn)無(wú)效，需重做 只有更換批號(hào)時(shí)，參數(shù)和參數(shù)值才需要改變（評(píng)估表中標(biāo)有參數(shù)與參考值）。組別特異性數(shù)據(jù)的正確輸入與否可以以標(biāo)準(zhǔn)血清的IU /ml或U / ml值為基礎(chǔ)進(jìn)行檢驗(yàn)。計(jì)算出的平均單位值需與組別特異性認(rèn)證書(shū)所示的單位值相對(duì)應(yīng)?？勺詣?dòng)校正測(cè)定值。使用標(biāo)準(zhǔn)版本打印機(jī)會(huì)顯示如下內(nèi)容：樣本編號(hào)OD值IU / ml 或 U / ml結(jié)果解釋8.4檢測(cè)結(jié)果分析對(duì)SERION ELISA classic肺炎支原體IgG, IgM 和IgA的臨界值進(jìn)行評(píng)估， 其中包 括對(duì)三個(gè)參量或僅一個(gè)或多個(gè)參量均顯示為陽(yáng)性的急性感染的評(píng)估。對(duì)IgG臨界

29、值范圍進(jìn)行設(shè)定是為了在 15%未經(jīng)篩選的獻(xiàn)血者中檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果或臨界結(jié)果。這會(huì)使臨床IgG檢測(cè)的上下限值更加清晰，從而取代了分析得岀的上下限值。通 過(guò)臨界值的確定可以將急性支原體感染情況同普通感染區(qū)分開(kāi)。IgA和IgM檢測(cè)結(jié)果是診斷急性肺炎支原體感染的重要參量。年齡較大患者經(jīng)常 會(huì)復(fù)發(fā)感染，所以在對(duì)這一群體檢測(cè)時(shí)僅有IgM檢測(cè)結(jié)果是不充分的，甚至在很多時(shí)候是沒(méi)有作用的，所以IgA測(cè)試結(jié)果對(duì)于此類(lèi)患者的檢測(cè)就具有更為重要的意義。IgM可以為初期感染的診斷提供可靠的依據(jù)。因?yàn)镮gG抗體在支原體感染的過(guò)程中才會(huì)產(chǎn)生，因此IgG檢測(cè)結(jié)果僅能用做確診支原體感染。因此，陽(yáng)性IgG檢測(cè)結(jié)果既可以表明血清檢岀

30、率，也可以體現(xiàn)岀不含IgA和IgM抗體的初期感染，但此種情況很少。支原體IgA支原體IgM支原體IgG檢測(cè)分析-陰性血清，當(dāng)臨床癥狀懷疑為支原體感染時(shí) 應(yīng)在14天內(nèi)持續(xù)提取血清進(jìn)行檢測(cè)+-/+懷疑為初期感染；特別是年輕患者通常檢測(cè) 為IgA及IgM均為陽(yáng)性。+-/+懷疑為初期感染（年長(zhǎng)患者復(fù)發(fā)感染時(shí)通常 檢測(cè)不到IgM ）-+繼往感染；或在少數(shù)情況下為初期感染，檢 測(cè)不到IgA和IgM抗體（注意IgG檢測(cè)濃度 的增長(zhǎng)）9.性能特征:9.1重復(fù)性重復(fù)性 是通過(guò)在同一輪試驗(yàn)中檢測(cè)20次不同反應(yīng)的血清來(lái)判斷。組間重復(fù)性 是通過(guò)分別在5天進(jìn)行的10次獨(dú)立的血清檢測(cè)分析來(lái)判斷。差異系數(shù)CV)標(biāo)準(zhǔn)差平均值

31、100賽潤(rùn) ELISA classic 肺炎支原體 IgG :平均消光值（OD）檢測(cè)內(nèi)分析（CV%）平均消光值（OD）檢測(cè)間分析（CV%）樣品不確定結(jié)果0.8354.900.90611.60陽(yáng)性1.2694.701.4706.90強(qiáng)陽(yáng)性1.5624.201.7905.90賽潤(rùn)ELISA classic肺炎支原體 IgM :平均消光值（OD）檢測(cè)內(nèi)分析（CV%）平均消光值（OD）檢測(cè)間分析（CV%）樣品陰性0.3757.700.43412.80陽(yáng)性1.5817.201.8235.50強(qiáng)陽(yáng)性1.7027.901.9438.30賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgA :平均消光值（OD）檢

32、測(cè)內(nèi)分析（CV%）平均消光值（OD）檢測(cè)間分析（CV%）樣品不確定結(jié)果0.5257.100.5786.40陽(yáng)性結(jié)果1.1558.601.2957.109.2敏感性及特異性在研究中使用賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體（IgG, IgA, IgM ）和另一種參照檢測(cè) 試劑（ELISA A ）分別對(duì)兩組血清集合進(jìn)行了檢測(cè)。必須指岀的是，對(duì)于肺炎支原體抗體的檢測(cè)尚未存在普遍的黃金標(biāo)準(zhǔn)。除了診斷 參數(shù)，如敏感性、特殊性及關(guān)聯(lián)性之外還要在對(duì)兩種測(cè)試系統(tǒng)的比較中考慮到臨 床背景因素。第一組血清集包括十一個(gè)來(lái)自不同廠家的血清樣本，在臨床方面已被預(yù)先定性。 第二組血清集包含的19個(gè)血清樣本取自感染肺炎

33、支原體或具有相似呼吸系統(tǒng)癥狀（如非典型肺炎，呼吸道感染）的病人。此項(xiàng)比較研究顯示結(jié)果如下：賽潤(rùn)ELISA c lassie肺炎支原體 IgG第一組血清檢驗(yàn)結(jié)果：血清號(hào)賽潤(rùn)ELISA classic IgGELISA AIgG預(yù)診斷1陰性陰性無(wú)感染2陰性陰性無(wú)感染3陰性陰性無(wú)感染4陰性不確定結(jié)果無(wú)感染5陽(yáng)性陽(yáng)性:六個(gè)月前感染6陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染7陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染8陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染9陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染10陽(yáng)性陽(yáng)性:三個(gè)月前感染11陽(yáng)性陽(yáng)性急性感染第二組血清檢驗(yàn)結(jié)果:SERION ELISAclassic IgGELISA AIgG陽(yáng)性99不確定結(jié)果30陰性710如果將ELISA A IgG 做參考試驗(yàn)

34、并將其制為100%的話(huà)，賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgG的測(cè)試將得到以下關(guān)鍵數(shù)據(jù)：ELISA AIgG賽潤(rùn) ELISA IgG陽(yáng)性不確定結(jié)果陰性陽(yáng)性1501不確定結(jié)果102陰性029關(guān)聯(lián)性*80%特異性：90%敏感性：100%*一致陽(yáng)性，陰性或不確定結(jié)果賽潤(rùn)ELISA classic肺炎支原體 IgA:第一組血清檢驗(yàn)結(jié)果:血清號(hào)賽潤(rùn)ELISA classic IgAELISA A IgA預(yù)診斷1陰性陰性無(wú)感染2不確定結(jié)果陰性無(wú)感染3陰性陰性無(wú)感染4陰性r陰性無(wú)感染5不確定結(jié)果陽(yáng)性六個(gè)月前感染6陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染7陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染8陽(yáng)性陽(yáng)性新近感染9陽(yáng)性p陰性新近感染10陽(yáng)性陰性三

35、個(gè)月前感染11陽(yáng)性陽(yáng)性急性感染第二組血清檢驗(yàn)結(jié)果:SERION ELISA classic IgAELISA AIgA陽(yáng)性107不確定結(jié)果21陰性711如果將ELISA A IgG 做為參考試驗(yàn)并將其制為100%的話(huà)，賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgA的測(cè)試將得到以下關(guān)鍵數(shù)據(jù):ELISA AIgA賽潤(rùn) ELISA IgA陽(yáng)性不確定結(jié)果陰性陽(yáng)性1015不確定結(jié)果004陰性109關(guān)聯(lián)性*59.4%特異性：64.3%敏感性：90.9%*一致陽(yáng)性，陰性或不確定結(jié)果與ELISA A IgA 相比，賽潤(rùn)ELISA classic IgA顯示岀很小的關(guān)聯(lián)性及很低的特異 性。如果考慮到臨床數(shù)據(jù)，

36、那么同ELISA A相比賽潤(rùn)ELISA classic顯示岀更強(qiáng)的敏感性：因此 ELISA A僅作為參考測(cè)試。賽潤(rùn)ELISA c lassie肺炎支原體 IgM:第一組血清檢驗(yàn)結(jié)果血清號(hào)賽潤(rùn)ELISAclassic IgMELISA AIgM預(yù)診斷1陰性陰性無(wú)感染2陰性陰性無(wú)感染3陰性陰性無(wú)感染4陰性陰性無(wú)感染5不確定結(jié)果陰性六個(gè)月前感染6陽(yáng)性陰性新近感染7陽(yáng)性臨界值新近感染8陽(yáng)性陰性新近感染9陽(yáng)性陰性新近感染10不確定結(jié)果陰性三個(gè)月前感染11陽(yáng)性陽(yáng)性急性感染第二組血清檢驗(yàn)結(jié)果:SERION ELISAclassic IgMELISA AIgM陽(yáng)性1211不確定結(jié)果00陰性78如果將ELISA

37、 A IgM 做為參考試驗(yàn)并將其制為100%的話(huà)，賽潤(rùn) ELISA classic肺炎支原體IgA的測(cè)試將得到以下關(guān)鍵數(shù)據(jù)：ELISA AIgM賽潤(rùn) ELISA IgM陽(yáng)性不確定結(jié)果陰性陽(yáng)性1214不確定結(jié)果002陰性0011關(guān)聯(lián)性*76.6%特異性：75%靈敏度：100%*完全相同的陽(yáng)性、臨界或陰性結(jié)果與ELISA A IgM 相比，賽潤(rùn) ELISA classic IgM 顯示岀很小的關(guān)聯(lián)性及很低的特 異性。如果考慮到臨床數(shù)據(jù)，那么同ELISA A相比賽潤(rùn)ELISA classic顯示岀更強(qiáng)的敏感性：因此 ELISA A 僅作為參考測(cè)試。.警告10.1警告和安全措施賽潤(rùn)ELISA clas

38、sic試劑盒是針對(duì)熟悉實(shí)驗(yàn)室操作人員所設(shè)計(jì)使用的。所有試劑盒試劑及人類(lèi)標(biāo)本必須采用已有的良好實(shí)驗(yàn)技術(shù)，小心處理:-此試劑盒內(nèi)含人血成分。盡管所有的對(duì)照及定點(diǎn)對(duì)照都已經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證并且 發(fā)現(xiàn)對(duì)于乙型肝炎表面抗原，丙型肝炎抗體，HIV抗體均為陰性；但仍認(rèn)為它們具有潛在的感染性。- 移液過(guò)程禁止用口。- 在處理試劑和標(biāo)本的地方禁止吸煙，飲食。- 使用試劑盒和標(biāo)本時(shí)，必須戴一次性手套，穿試驗(yàn)服，戴安全鏡。使用后請(qǐng) 徹底洗手清潔?；颊邩颖炯捌渌麧撛诟腥静牧显囼?yàn)后應(yīng)予以消毒。- 終止液：具有腐蝕性（ C ）；因此在操作時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)鏡，手套和試驗(yàn)服。10.2 廢料處理請(qǐng)注意相關(guān)要求！11. 參考文獻(xiàn)1. Br

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