腸道病毒感染病例標本的處理細胞接種和觀察

1、2021/4/272人腸道病毒簡介和分類 小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成員，主要 在腸道內(nèi)復制, 但可感染各個系統(tǒng)和器官。 單正鏈的無包膜RNA病毒，RNA有感染性。 小球形病毒（ 30 nm）， 20面體對稱結(jié)構(gòu)。 衣殼有VP1-VP4四種蛋白，VP1-VP3分布在表面， VP4與內(nèi)部RNA結(jié)合。 與鼻病毒不同的是，它們在酸性環(huán)境中穩(wěn)定。 在胞漿增殖，有明顯CPE，破胞釋放。 引起多種疾?。郝楸孕约膊?、無菌性腦膜炎、心肌 損傷、手足口病，結(jié)膜炎，皮疹等。2021/4/273電鏡下的病毒形態(tài)2021/4/2742021/4/275病毒特性 腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存

2、與傳播，對乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感，75%酒精和5%來蘇亦不能將其滅活，但對紫外線及干燥敏感。各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒都能滅活病毒。病毒在50 可被迅速滅活，但1mol濃度二價陽離子環(huán)境可提高病毒對熱滅活的抵抗力，病毒在4 可存活1年，在- 20 可長期保存，在外環(huán)境中病毒可長期存活。2021/4/276人腸道病毒傳播方式 糞-口途徑傳播: 唾液與糞便 呼吸道傳播: 空氣飛沫 接觸傳播:一般人腸道病毒在呼吸道飛沫中可存留約一至三周，而經(jīng)胃腸道的糞便排泄可達到二至三個月以上。2021/4/277病毒的組織培養(yǎng) 所有已知的人腸道病毒都可以在組織細胞培養(yǎng)或乳鼠中繁殖； 大部分血清

3、型可以在1種以上的人源傳代細胞中生長； 但是沒有哪一種細胞可以支持所有的人腸道病毒生長； 研究至今，一些血清型（如Cox A1病毒）只能在乳鼠中繁殖。2021/4/278實驗室檢測方法 臨床懷疑：夏秋季，嬰幼兒、皮疹、接觸、腦膜炎 實驗室的檢測方法包括： 1)血清抗體的變化： 血清抗體4倍變化 2)病毒培養(yǎng)及鑒定：理想（金標準）但費時費力，且部分腸病毒型別不易培養(yǎng) 3)組織病理切片檢查 4)分子生物學檢測，RT-PCR，RealTime PCR，分子雜交等 5)快速抗原檢測：芯片2021/4/279 病毒分離 診斷腸道病毒感染的最主要手段，也是金標準。 柯薩奇B組病毒和?？刹《究梢院苋菀椎卦诩?/p>

4、胞培養(yǎng)上生長。適合的標本有咽拭子、糞便標本，鼻拭子等，也可以從腦脊液中分離到病毒。 一些柯薩奇A組病毒不容易通過細胞培養(yǎng)進行分離，可以通過乳鼠進行分離，但是操作比較復雜，一般實驗室不常規(guī)使用這種方法。分子生物學的方法更適合這種病毒的診斷。 血清學方法 自從細胞培養(yǎng)已經(jīng)可以用做病毒分離后，血清學方法已經(jīng)不經(jīng)常使用了。 中和實驗，但是非常繁瑣，因此，一般也不做這方面的實驗。2021/4/2710細胞培養(yǎng)分離方法 1990年以前，大都都采用Vero、GMK細胞分離； 1994年以后，人結(jié)腸癌上皮細胞（Caco-2）取代了Vero細胞； 1998年人們開始用人肺系細胞（MRC-5）分離CoxA16等毒

5、株，其敏感性與Caco-2細胞相當。 目前，大都使用人源細胞如人喉癌上皮細胞（HEp-2）、人橫紋肌肉瘤細胞（RD）用于病毒分離。RD細胞支持大多數(shù)柯薩奇A組病毒復制。 對一些不能在細胞上生長的病毒，可用乳鼠接種分離病毒。但?？刹《疽话悴灰鹑槭蟀l(fā)病。2021/4/2711標本的采集 （一）糞便標本：采集病人發(fā)病7日內(nèi)的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量58g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，4暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。 （二）咽拭子標本：采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部

6、位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。4暫存立即（12h內(nèi)）送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。 （三）血清標本：采集急性期（發(fā)病03d）和恢復期（發(fā)病1430d）雙份配對血清用于抗體檢測。靜脈采集35ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于20以下冰箱中冷凍保存。2021/4/2712 （四）皰疹液：在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒具有很高的診斷價值，可同時采集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消

7、毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有35ml保存液（維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標本4暫存立即（12h內(nèi)）送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。 （五）腦脊液標本：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，要采集腦脊液標本，進行病原和抗體檢測，從腦脊液中分離病毒也具有很高的診斷價值。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.02.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內(nèi))送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。 （六）病例密切接觸者的標本采集

8、：選擇典型病例所在的托幼機構(gòu)、或所在村，以新發(fā)病例密切接觸者為采樣對象，采集單份糞便和血清標本。 （七）健康對照的標本采集：選擇患兒發(fā)病所在社區(qū)（村）的臨近無病例的社區(qū)（村）或托幼機構(gòu)。采集5歲以下的兒童單份糞便和血清標本。2021/4/2713手足口病 引起手足口病的主要為小RNA病毒科、腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackie virus) A組16、4、5、7、9、10 型， B組2、5型；?？刹《荆‥CHO viruses）和腸道病毒71型（EV 71），其中以EV 71及Cox Al6型最為常見。 感染后引起 發(fā)熱, 不適, 咽喉腫痛, 口腔、手、腳側(cè)面及掌心、屁股出現(xiàn)小泡 傳染性

9、極高 病程約1周2021/4/2714手足口病發(fā)病機理 致病性與柯薩奇病毒類似，呈多樣性，主要是無菌性腦炎、類脊髓灰質(zhì)炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 感染后對同型病毒可產(chǎn)生持久免疫 診斷困難，對可疑患者可采糞便、腦脊液等標本做病毒分離和中和試驗 尚無疫苗，預防以隔離為主2021/4/2715用于病毒分離和鑒定標本的種類 用于HFMD病毒分離的標本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標本。 用于AHC病毒分離的標本主要是結(jié)膜拭子或結(jié)膜刮取物。 用于HFMD病毒分離的標本包括糞便、咽拭子和皰疹液，如果患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可以采集腦脊液標本。 用于AHC病毒分離的標本主要是結(jié)膜

10、拭子或結(jié)膜刮取物。 注意：雖然都是腸道病毒，但不同的病例采樣的部位不同，不同的腸道病毒采用的組織培養(yǎng)也是不同的。2021/4/2716標本的處理1、糞便標本的處理 A）所需試劑和耗材： 15ml或50ml耐氯仿離心管； 1ml 或5ml吸氯仿用的玻璃吸管； 5ml和10ml吸管； 木制便簽； 外螺旋蓋的凍存管（5ml）； 直徑大約23mm的玻璃珠； 混有抗生素的完全PBS；完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素500單位/ml，鏈霉素為500g/ ml 氯仿（以乙醇作為穩(wěn)定劑）。2021/4/2717 B)糞便標本處理操作步驟：生物安全柜中操作 將離心管上標記標本號; 每一管中加入10ml

11、 完全PBS ，2g玻璃珠，1ml氯仿; 在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確認原始標本號與離心管上標記的編號一致），剩余原始標本最好留在原容器中并凍存于-20。 擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20分鐘。 將離心管上標記標本號;用冷凍離心機離心1500g*（約3500轉(zhuǎn)）20分鐘。 將每一份標本上清吸入2個有外螺旋蓋的標記好的凍存管中（若上清不清澈，應再用氯仿處理一次）。 將一管糞便懸液凍存于-20作為備份，另一管存于4-8以備接種（用于當天接種細胞）。2021/4/2718 2、腦脊液標本的處理-通常直接用于病毒分離。 3、皰疹液標本的處理-通常直接用于病毒分離

12、。 4、咽拭子標本的處理 咽拭子要在保存液中充分攪動（40下左右），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，然后4條件下10000rpm離心20min，用上清接種到細胞上，如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，用濾器過濾除菌。 5、眼結(jié)膜拭子標本的處理同咽拭子標本的處理。2021/4/2719病毒分離 標本接種和觀察 A）所需試劑和耗材： 細胞培養(yǎng)管培養(yǎng)的RD細胞和HEp-2細胞； 維持液（MM）； 1ml和5ml的一次性塑料移液管2021/4/2720 B）操作步驟： 顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康的。一個健康的單層細胞會在傳代后3d左右形成； 倒掉（GM），換上11.2ml（MM）； 每一份標本同

13、時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記細胞管（包括標本編號、日期、傳代數(shù)）； 每一種細胞至少標記一管作為陰性對照； 每支試管接種0.2ml標本懸液，培養(yǎng)溫度要求36（對于AHC標本病毒分離，尤其是EV70，強烈建議降低培養(yǎng)溫度，一般可為35）； 使用倒置顯微鏡逐日觀察并如實記錄細胞培養(yǎng)管的變化，至少一周。包括記錄： CPE（1+4+）： （1+，25%; 2+, 25%50%; 3+, 50%75%; 4+, 75%100%）； 細胞毒性反應; 細胞老化或污染. 關(guān)于腸道病毒CPE：即有特征性的腸道病毒致細胞病變效應，表現(xiàn)為細胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加， 折光性增強至細胞從管壁脫落

14、。2021/4/2721 如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)至觀察到75%的細胞發(fā)生變化（3+ CPE），凍存于-20以備二次傳代。同一病例二次傳代的病毒分離物其滴度高于一代病毒，二代分離物可放到一起用于進一步鑒定； 第1代培養(yǎng)見可疑CPE至觀察滿7天后再繼續(xù)凍融傳代，待CPE穩(wěn)定出現(xiàn)后-20或-70凍存以備進一步鑒定； 如果7天之后沒有CPE出現(xiàn)，需盲傳2代繼續(xù)觀察。（注意：同一病例標本的不同細胞的培養(yǎng)物應單獨傳代）； 盲傳2代后仍不出現(xiàn)CPE，則判定為陰性； 注意：盲傳不可超過3代。2021/4/2722相關(guān)概念 A：毒性反應：如果在接種后12d內(nèi)細胞快速地凋亡，這可能是由于標本中含有毒性物

15、質(zhì)而導致的非特異性毒性反應。將這些已接種標本的試管凍存于-20，融化后取0.2ml接種到同一類型細胞中（此時是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應，可重取原始標本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時應被認為是第一代。 B：微生物污染：由于細菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。重新取原始標本，用氯仿處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。 C：盲傳：有時一周之后傳代細胞會老化，甚至細胞對照也出現(xiàn)了病變?？蓪⒁呀臃N標本試管于-20凍存，融化后取0.2ml再接種到同一類型健康單層細胞，再觀察7天。若盲傳2代仍未產(chǎn)生CPE，即可確認此標本為陰性。2021/4

16、/2723HFMD結(jié)果解釋 1.RD細胞支持CA16和EV71的復制，但一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯病變，若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒(如COXB及ECHO）分離率。 2.從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等分離出病毒有診斷價值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。需滿足以下2 個要求。才有診斷的參考價值： 1）從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復分離到同一型病毒; 2）病毒分離率遠高于正常人群。 3.相同滴度的CA16和EV71在RD細胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細胞后出現(xiàn)CPE的時間比CA16

17、早。兩者在HEp-2細胞中均不繁殖。2021/4/2724需要注意的兩個問題A額外的傳代：在進行HFMD/AHC標本病毒分離過程中，為防止從病例中分離出的標本中有人腸道病毒漏檢情況，此時接種過病毒的細胞懸液經(jīng)過凍化后，可重新接種到新的健康單層細胞上以釋放存在的病毒。在標本培養(yǎng)沒有產(chǎn)生CPE的情況下，特別是發(fā)生毒性反應或污染時，使用新的健康細胞可能會產(chǎn)生可識別CPE。但病毒傳代不要超過3次，因為每一次操作都會增加病毒交叉污染的機會，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。B標本吸附到單層細胞上方法：先將細胞生長液倒掉，用無菌PBS清洗單層健康細胞，再接種0.2ml標本懸液使其先吸附到單層細胞上。吸附過程(1h)中輕搖并偶爾旋轉(zhuǎn)使接種液分布均勻，以防止周圍層細胞干燥。然后再加入1ml的維持液。優(yōu)點：可檢