DNA重組技術(shù)的基本原理

1、第十五章第十五章 DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)的基本原理的基本原理第一節(jié)第一節(jié) DNADNA重組的技術(shù)要件重組的技術(shù)要件DNA重組技術(shù)：基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)方法，把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning克?。蜃詈蟮玫奖磉_，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀?；蚬こ痰年P(guān)鍵技術(shù)是DNA重組，但二者并不等同。DNA重組的 技術(shù)路線Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningR

2、ecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制備、目的基因的制備2、載體的構(gòu)建、載體的構(gòu)建3、目的基因與載體的重組、目的基因與載體的重組4、重組、重組 體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進行體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進行擴增擴增5、克隆基因的鑒定、克隆基因的鑒定一、重要的工具酶及其作用特點一般把DNA 分子切割、DNA片段末

3、端修飾和DNA片段連接等所用的酶稱為工具酶。（一）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（Restriction endonuclease）：是一類以環(huán)狀或線形雙鏈DNA為底物，能識別DNA中的特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下，使每條的一個磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生-OH和5 -P基團DNA片段的內(nèi)脫氧核酸酶(endodeoxyribonuclease)。（二）DNA連接酶DNA連接酶（ligase）：能夠催化兩個DNA片段末端之間的-P基團和-OH基團形成磷酸二酯鍵的酶。（三）DNA聚合酶（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（五）RNA聚合酶二、目的基因的載體類型及其功能二、目的基因的載體類型及其功能載體（vector）: 能夠攜

4、帶外源基因進入受體細(xì)胞的DNA分子。基因克隆載體必備條件：（1）受體細(xì)胞本來就有的或受體細(xì)胞可以接受的；（2）具有能使外源DNA片段插入的多克隆位點（ MCS，multiple cloning site）；（3）能進行自我復(fù)制，具有復(fù)制原點（ORI，origin ）；（4）具有選擇標(biāo)記，承載外源DNA片段的載體進入細(xì)胞后，以便篩選克隆子。（一）質(zhì)粒及其功能（二）噬菌體及其功能（三）考斯質(zhì)粒（四）動物病毒的載體作用（五）植物寄生菌作為目的DNA的載體Ti質(zhì)粒（Ti plasmid）：是一種細(xì)菌質(zhì)粒，存在于土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens） （革蘭氏陰菌）細(xì)胞中，可誘

5、導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞( Tumor- inducing, Ti )，冠癭瘤（grown galltumors)。 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞第二節(jié) DNA重組的基本技術(shù)步驟1、目的基因的制備2、目的基因與載體的重組3、重組 體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進行擴增4、克隆基因的鑒定Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeSlection for cells c

6、oteining a recombinant DNA moleculeCloning+一、目的基因的制備方法基因工程的主要目的是通過優(yōu)良性狀相關(guān)基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價值的新物種。為此，必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離用于克隆的此類基因，這樣的基因通常稱為目的基因。（一）建立DNA文庫某種生物基因組全部遺傳信息的一系列DNA片段，通過克隆載體貯存在一種受體菌的群體之中，這種包含某生物基因組全部DNA片段受體菌群體（一套克?。┓Q為這種生物的基因組文庫。 基因組文庫建立順序基因文庫和cDNA文庫的建立組織組織可克隆之可克隆之DNA載體載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解部分或完全酶解D

7、NADNA長度分級長度分級甲基化，雙鏈接頭甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接與載體連接引入大腸桿菌引入大腸桿菌鑒定文庫的滴度和特性鑒定文庫的滴度和特性擴增后供長期擴增后供長期儲存儲存篩選出所需要的篩選出所需要的克隆克隆（三）人工合成（三）人工合成DNADNA片段片段（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增DNA 1 PCR的原理：的原理：1985年年Mullis發(fā)明發(fā)明PCR（ polymerase chain reaction）快速擴增快速擴增DNA的方法。該法模仿體內(nèi)的方法。該法模仿體內(nèi)DNA的復(fù)制過程，首先使的復(fù)制過程，首先使DNA變變性，兩條鏈解開，然后使引物模板退火，二者堿基配對，性，

8、兩條鏈解開，然后使引物模板退火，二者堿基配對，DNA聚合酶隨聚合酶隨即以即以4種種dNTP為底物，在引物的引導(dǎo)下合成與模板互補的為底物，在引物的引導(dǎo)下合成與模板互補的DNA新鏈。重新鏈。重復(fù)此過程，復(fù)此過程，DNA以指數(shù)方式擴增。以指數(shù)方式擴增。擴增的公式為擴增的公式為: Y=(1+X)n 式中式中 y一產(chǎn)量一產(chǎn)量; X-擴增效率擴增效率;n一循環(huán)次數(shù)。一循環(huán)次數(shù)。PCR技術(shù)原理示意圖靶序列靶序列變性和引物復(fù)變性和引物復(fù)姓姓循環(huán)循環(huán)1循環(huán)循環(huán)2循環(huán)循環(huán)3變性和引物復(fù)變性和引物復(fù)姓姓鏈延伸鏈延伸Tag酶酶鏈延伸鏈延伸二、目的二、目的DNADNA和載體的體外連接和載體的體外連接目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

9、之前，一般須先把含目的基因的DNA片段組入合適的克隆載體。三、將重組的三、將重組的DNADNA復(fù)合物導(dǎo)入受體細(xì)胞復(fù)合物導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的受體細(xì)胞：是能攝取外源DNA(基因)并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應(yīng)用。感受態(tài)細(xì)胞: 指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。（一）重組DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌是用得最廣泛的基因克隆受體。轉(zhuǎn)化（transformation） ： 攜帶目的基因的外源DNA分子通過與膜結(jié)合進入受體細(xì)胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達的過程。以質(zhì)粒為載體。 轉(zhuǎn)化（二）噬菌體重組體的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染：通過噬菌體(病毒)顆粒感染，把DN

10、A導(dǎo)入被感染的受體細(xì)胞的過程。含目的基因的DNA與噬菌體（病毒）載體的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，必須進行體外包裝。四、重組克隆的篩選方法（一）利用載體的特殊標(biāo)記進行篩選（二）對菌落原位雜交法鑒定克隆 先制備含目的基因的DNA片段的探針，隨后采用斑點雜交或DNA印跡(southern blotting)等方法進行鑒定。（1）斑點雜交法 提取待鑒定的克隆子的總DNA，直接固定在分子雜交的膜上，用含目的基因DNA片段的探針與其雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號，可認(rèn)為是真的克隆子。（2）southern雜交法 斑點雜交、菌落雜交和噬菌斑雜交只能說明克隆子中含目的基因，但不能顯示目的基因定位在受體細(xì)胞內(nèi)的染

11、色體基因組上還是其他基因組上。而southern雜交（DNA印跡）則可對它進行定位。 （三）免疫學(xué)方法鑒定克?。ㄈ┟庖邔W(xué)方法鑒定克隆蛋白質(zhì)印跡（western blotting）法：提取克隆子總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開后，轉(zhuǎn)移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，通過抗原抗體反應(yīng)，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號，表明受體細(xì)胞中存在目的基因表達產(chǎn)物。第三節(jié)第三節(jié)DNADNA重組技術(shù)的應(yīng)用前景重組技術(shù)的應(yīng)用前景基因工程應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長激素二、植物基因工程轉(zhuǎn)化基因植物是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和

12、表達的過程。許多植物基因已經(jīng)被分離、克隆。植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)也得到不斷發(fā)展和完善。應(yīng)用最多的為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化。抗蟲稻對照對照轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲品種受精卵細(xì)胞注射轉(zhuǎn)基因牛：受精卵注射法轉(zhuǎn)移有人類生長激素轉(zhuǎn)基因鼠人類生長激素轉(zhuǎn)基因豬四、遺傳疾病診斷與基因治療利用基因診斷法進行遺傳疾病診斷，是直接從 DNA即基因水平進行診斷 ， 準(zhǔn)確度高，速度快。如進行產(chǎn)前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者的基因組中使疾病得到糾正或治愈，通常叫做基因治療(gene therapy)。方法：減毒的病毒DNA作載體(retro virus DNA) 構(gòu)建重組DNA分子用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細(xì)胞 將正?；蛘系饺旧w上。2000年法國Fischer用基因工程方法治愈患有SCID（嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷）遺傳病的兩個嬰兒(8個月和11個月) 。這一工作被認(rèn)為是20世紀(jì)人類基因治療上的重大突破。 （二）DNA連接酶DNA連接酶（ligase）：能夠催化兩個DNA片段末端之間的-P基團和-OH基團形成磷酸二酯鍵的酶。（三）DNA聚合酶（四）逆轉(zhuǎn)錄酶誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞三、將重組的三、將重組的DNADNA復(fù)合物導(dǎo)入受體細(xì)胞復(fù)合物導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的受