蛋白質(zhì)的鹽析

1、蛋白質(zhì)的鹽析（驗證型）一、實驗目的了解在工業(yè)化生產(chǎn)過程中使用（NH。的情況，及（NH；） 601使用 時的注意事項。二、實驗原理用高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來的方法稱鹽析。常用的 中性鹽有（NHJ 60八NaCl等。高'濃度中性鹽能使蛋白質(zhì)沉淀是因為它 具有脫水性，能脫去蛋白質(zhì)膠粒水膜，又有中和蛋白質(zhì)膠粒外雙電層電荷 的作用。不同蛋白質(zhì)鹽析時所需鹽濃度不同，故調(diào)節(jié)鹽濃度，可適當?shù)貙?蛋白質(zhì)分開。如球蛋白在半飽和硫酸鍍?nèi)芤褐谐恋?，清蛋白在飽和硫酸銹 溶液中沉淀，用鹽析法沉淀的蛋白質(zhì)并未變性，用稀釋的方法或透析的方 法可使之復溶。三、器材與試劑1、發(fā)酵溶液2、10%的三氯醋酸溶液3

2、、飽和（陽）人01溶液4、（NH）£04粉末四、實驗步驟（1） 取發(fā)酵溶液 5ml,加飽和（NH- 2SO4 溶液 lml 2ml 3ml 4ml 5ml, 混勻，靜止數(shù)分鐘，即有白色沉淀析出，應(yīng)為何物過濾至清，除去沉淀， 濾液備用。取少量沉淀，加HQ看是否復溶 取濾液0.5ml,加10%的三氯醋酸數(shù)滴，有白色沉淀產(chǎn)生，應(yīng)為何 物然后在721分光光度計0D6。下進行透光率的檢測，檢測時必須在倒入比 色皿以后10秒內(nèi)讀?。槭裁矗?。（在進行檢測時應(yīng)注意將721分光光 度計調(diào)整到0D6。；在測量前應(yīng)把機器預熱半小時左右。在檢測時應(yīng)注意有 效的檢測范圍是T值15%以上到70%以下）。（3）

3、 另外,取濾液2. 5ml于小燒杯中，加（NH.） 2soi粉末,隨加隨攪拌, 直至（NH1 不能溶解為止，有白色沉淀產(chǎn)生，應(yīng)為何物然后過濾至清， 除去沉淀，過濾備用。 將（1） -（3）做的濾液中加10%三氯醋酸數(shù)滴觀察有無沉淀產(chǎn)生。 找到?jīng)]有沉淀的加飽和（NHJ 2SO1溶液的點。然后在721分光光度計0D6。 下進行透光率的檢測。并且作出曲線。 對大量的發(fā)酵液進行處理，在濾液中加10%三氯醋酸數(shù)滴觀察有 無沉淀產(chǎn)生。（6）鹽析曲線的制作方法：如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸鉉飽和度。具體操作方法如 下：取已定量測定蛋白質(zhì)或酶的活性與濃度的待分

4、離樣品溶液，冷至0C 5,調(diào)至該蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH值，分610次分別加入不同量的硫酸銹， 第一次加硫酸筱至蛋白質(zhì)溶液剛開始出現(xiàn)沉淀時，記下所加硫酸錢的量， 這是鹽析曲線的起點。繼續(xù)加硫酸鉉至溶液微微混濁時，靜止一段時間， 離心得到第一個沉淀級分，然后取上清再加至混濁，離心得到第二個級分， 如此連續(xù)可得到610個級分，按照每次加入硫酸錢的量，查出相應(yīng)的硫 酸鉉飽和度。將每一級分沉淀物分別溶解在一定體積的適宜的pH緩沖液 中，測定其蛋白質(zhì)含量和酶活力。以每個級分的蛋白質(zhì)含量和酶活力對硫 酸鉉飽和度作圖，即可得到鹽析曲線。五、鹽析注意事項：1 .鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強度，溶液pH值越接近

5、蛋白的等 電點，蛋白質(zhì)越容易沉淀。2 .鹽析一般用的硫酸鏤，容易吸潮，因而在使用前., 一般先磨碎，平鋪放 入烤箱內(nèi)60烘干后再稱量，這樣更準確。3 .在加入鹽時應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應(yīng)該更注意緩 慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局 部的鹽濃度過高，導致酶失活。4 .鹽析后最好攪拌40分鐘到一個小時而且再在冰浴中放置一段時間。為 了避免鹽對酶的影響，一般脫鹽處理后再測酶活性。5 .鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超 濾或者G-25, G-50處理。6 . 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸銹濃度在70%左右。六、鹽析影響因

6、素：1 .蛋白質(zhì)的濃度：中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時，溶液中蛋白質(zhì)的實際濃度對分 離的效果有較大的影響。通常高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸鉉飽和度即可 將其沉淀下來，但若蛋白質(zhì)濃度過高，則易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用， 除雜蛋白的效果會明顯下降。對低濃度的蛋白質(zhì)，要使用更大的硫酸鐵飽 和度，但共沉淀作用小，分離純化效果較好，但回收率會降低。通常認為 比較適中的蛋白質(zhì)濃度是2. 5%3. 0%,相當于25 mg/mL30mg/mL。2 .離子強度：各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強度。3 .鹽的性質(zhì)：最有效的鹽是多電荷陰離子。4 . pH值：一般說來，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變 pH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。遠離等 電點處溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時，pH 值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。5 .溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4）操作外，一般可在室溫中 進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅 蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25）比0C時溶解度低，更容易鹽析。 蛋白質(zhì)沉淀后宜在4c放3小時以上或過夜，以形成較大沉淀而易于分離。 鹽析時，分子量較小的蛋白質(zhì)逐步沉