培養(yǎng)基的滅菌

1、2021/6/161 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌2021/6/162滅菌的原理及方法滅菌的原理及方法培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌工藝培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌工藝 2021/6/163 滅菌：指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去滅菌：指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過(guò)程。藝過(guò)程。 消毒：消除病原微生物的措施。消毒：消除病原微生物的措施。在工業(yè)中一般都籠統(tǒng)地稱為殺菌或滅菌。在工業(yè)中一般都籠統(tǒng)地稱為殺菌或滅菌。2021/6/164生產(chǎn)菌和雜菌同時(shí)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，結(jié)果喪失了生產(chǎn)生產(chǎn)菌和雜菌同時(shí)在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，結(jié)果喪失了生產(chǎn)能力。能力。雜菌的生長(zhǎng)速度有

2、時(shí)比生產(chǎn)菌生長(zhǎng)得快，結(jié)果使反應(yīng)雜菌的生長(zhǎng)速度有時(shí)比生產(chǎn)菌生長(zhǎng)得快，結(jié)果使反應(yīng)器中以雜菌為主。器中以雜菌為主。雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品。雜菌會(huì)污染最終產(chǎn)品。雜菌所產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取產(chǎn)物時(shí)發(fā)生困難。雜菌所產(chǎn)生的物質(zhì)，使提取產(chǎn)物時(shí)發(fā)生困難。雜菌降解所需要的產(chǎn)物。雜菌降解所需要的產(chǎn)物。發(fā)酵如污染了噬菌體，可使生產(chǎn)菌株發(fā)生溶菌現(xiàn)象。發(fā)酵如污染了噬菌體，可使生產(chǎn)菌株發(fā)生溶菌現(xiàn)象。如有雜菌，可引起以下的后果：如有雜菌，可引起以下的后果：2021/6/165第一節(jié)第一節(jié) 滅菌的原理及方法滅菌的原理及方法一一. 幾種常見(jiàn)的滅菌方法幾種常見(jiàn)的滅菌方法 1. 化學(xué)試劑滅菌法化學(xué)試劑滅菌法 原理：藥物與微生物細(xì)胞中的成分反

3、應(yīng)，使原理：藥物與微生物細(xì)胞中的成分反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性、酶失活。蛋白質(zhì)變性、酶失活。 使用范圍：使用范圍： 器皿、雙手和實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌室的環(huán)境滅菌，器皿、雙手和實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌室的環(huán)境滅菌， 不能用于培養(yǎng)基滅菌不能用于培養(yǎng)基滅菌。常用的滅菌劑常用的滅菌劑:2021/6/166常用的滅菌劑常用的滅菌劑化學(xué)物質(zhì)名稱化學(xué)物質(zhì)名稱 有效濃度有效濃度化學(xué)物質(zhì)名稱化學(xué)物質(zhì)名稱 有效濃度有效濃度新潔爾滅新潔爾滅(苯扎溴銨苯扎溴銨)0.25%甲醛甲醛37%杜滅芬杜滅芬0.25%戊二醛戊二醛2%高錳酸鉀高錳酸鉀0.1%-0.25%苯酚苯酚0.1-0.15%漂白粉漂白粉5%過(guò)氧乙酸過(guò)氧乙酸0.02%-0.2%酒精酒精7

4、5%焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1%煤酚皂（來(lái)蘇煤酚皂（來(lái)蘇爾）爾）1%-5%2021/6/1672. 輻射滅菌輻射滅菌原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)造成菌體死亡。的光化學(xué)反應(yīng)造成菌體死亡。常用：紫外線、常用：紫外線、X射線和射線和射線。射線。使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌。 2021/6/1683干熱滅菌法干熱滅菌法原理：利用高溫對(duì)微生物有氧化、蛋白質(zhì)變?cè)恚豪酶邷貙?duì)微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。 常用方法：灼燒和電熱箱加熱，

5、常用方法：灼燒和電熱箱加熱，140-180 1-2小時(shí)。小時(shí)。使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌 2021/6/1694濕熱滅菌法濕熱滅菌法 原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質(zhì)易變性。且在高溫有水分條件下，蛋白質(zhì)易變性。常用方法：常用方法： 水煮常壓滅菌：水煮常壓滅菌：100 飽和蒸汽滅菌：一般飽和蒸汽滅菌：一般121，30分鐘分鐘使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌 2021/6/16105過(guò)濾除菌法過(guò)濾除菌法 原理：利用微生物不能透過(guò)濾膜除菌。原理：利用微

6、生物不能透過(guò)濾膜除菌。方法方法: 0.010.45 m孔徑濾膜。孔徑濾膜。使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。熱化合物溶液除菌。 2021/6/16116火焰滅菌法火焰滅菌法n原理：利用火焰直接殺死微生物。原理：利用火焰直接殺死微生物。n使用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口使用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口2021/6/16121.微微生物熱死動(dòng)力學(xué)（對(duì)數(shù)殘存定律）生物熱死動(dòng)力學(xué)（對(duì)數(shù)殘存定律） - dN / dt =K N N：菌體個(gè)數(shù)（個(gè)）菌體個(gè)數(shù)（個(gè)） t : 滅菌時(shí)間（滅菌時(shí)間（S）k：反應(yīng)速度常數(shù)（反應(yīng)速度常數(shù)（S-1） d

7、N / dt: 菌體受熱死亡速率菌體受熱死亡速率2021/6/1613Ln N/ N0 = - K t N= N0 e- K t 以菌體的殘留數(shù)以菌體的殘留數(shù)Ln N/ N0的對(duì)數(shù)與時(shí)間的對(duì)數(shù)與時(shí)間t 作圖，得出一條直線，其斜率為作圖，得出一條直線，其斜率為- K 。2021/6/16142 .反應(yīng)速率常數(shù)反應(yīng)速率常數(shù)K如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)根據(jù)對(duì)數(shù)殘存定律確定某一溫度如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)根據(jù)對(duì)數(shù)殘存定律確定某一溫度,某一微生物的某一微生物的K ？ 1). K 與菌種的特性有關(guān)與菌種的特性有關(guān) 相同溫度下，微生物越耐熱，相同溫度下，微生物越耐熱， k值越小。值越小。相同溫度下，微生物越不耐熱，相同溫度下，微生物

8、越不耐熱，k值越大。值越大。 2021/6/1615n2). K 與滅菌溫度有與滅菌溫度有關(guān)關(guān) nK=A e E / RT n（阿累尼烏斯方程）阿累尼烏斯方程） nLn K =Ln A- E/ RT nA：比例常數(shù)比例常數(shù) nR：氣體常數(shù)氣體常數(shù)(J/ mol K) nT：絕對(duì)溫度絕對(duì)溫度( K) nE：殺死細(xì)菌所需的活殺死細(xì)菌所需的活化能（化能（J/ mol） 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢的熱死曲線0.00010.0010.010.110510152025加熱時(shí)間（m i n ）N/N01211181151101052021/6/1616第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌工藝培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌

9、工藝 一培養(yǎng)基滅菌時(shí)間的選擇一培養(yǎng)基滅菌時(shí)間的選擇 t =1/ k * Ln( N0/ N) 其中其中 K：一般耐熱的細(xì)菌芽孢的一般耐熱的細(xì)菌芽孢的K值值 N0 ：細(xì)菌及芽孢數(shù)之和細(xì)菌及芽孢數(shù)之和 N：10 -3 2021/6/1617二二. 培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇選擇即能達(dá)到滅菌要求，選擇即能達(dá)到滅菌要求，又保證營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞的溫度。又保證營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞的溫度。2021/6/1618三三 影響滅菌效果的因素影響滅菌效果的因素 微生物種類：不同的微生物微生物種類：不同的微生物k值不同。值不同。初始菌量：在保持初始菌量：在保持N值不變的前提下，值不變的前提下，t 與初與初始

10、菌量始菌量N0的對(duì)數(shù)成正比。的對(duì)數(shù)成正比。 培養(yǎng)基成份：油脂、蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱培養(yǎng)基成份：油脂、蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱性。性。 傳熱與混合狀況：影響受熱均勻度。傳熱與混合狀況：影響受熱均勻度。 培養(yǎng)基中固體顆粒的存在影響熱穿透。培養(yǎng)基中固體顆粒的存在影響熱穿透。 蒸汽中空氣的存在降低蒸汽分壓和滅菌溫度。蒸汽中空氣的存在降低蒸汽分壓和滅菌溫度。 pH：酸性酸性pH下可加快微生物熱死速率下可加快微生物熱死速率 。 2021/6/1619四四. 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌方法（一）實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)基滅菌方法（一）實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)基滅菌方法 手提式滅菌鍋。手提式滅菌鍋。容量小。

11、容量小。使用高壓蒸汽滅菌鍋使用高壓蒸汽滅菌鍋2021/6/1620立式或臥式滅菌鍋。立式或臥式滅菌鍋。容量較大，容量較大，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。一般能裝幾十瓶或幾百瓶。2021/6/1621滅菌柜。滅菌柜。要和蒸汽鍋爐配套，用于大要和蒸汽鍋爐配套，用于大量種瓶培養(yǎng)基的滅菌，一次量種瓶培養(yǎng)基的滅菌，一次能裝幾百至幾千瓶能裝幾百至幾千瓶(袋袋)。2021/6/1622（二）分批滅菌（二）分批滅菌(batch sterilization） 1定義：定義： 將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中，用蒸汽加將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中，用蒸汽加熱，使培養(yǎng)基和設(shè)備同時(shí)滅菌的一種滅菌方熱，使培養(yǎng)基和設(shè)備同時(shí)滅菌的一

12、種滅菌方式。式。 2021/6/16232操作過(guò)程：操作過(guò)程：空罐準(zhǔn)備：清洗、檢修和檢測(cè)?？展逌?zhǔn)備：清洗、檢修和檢測(cè)。升溫：把培養(yǎng)基加熱到滅菌所需的溫度。升溫：把培養(yǎng)基加熱到滅菌所需的溫度。保溫維持：在滅菌溫度下保持滅菌所需時(shí)保溫維持：在滅菌溫度下保持滅菌所需時(shí)間。間。 冷卻保壓：把培養(yǎng)基的溫度降低到接種的冷卻保壓：把培養(yǎng)基的溫度降低到接種的溫度。溫度。2021/6/16242021/6/1625溫度隨滅菌時(shí)間的變化溫度隨滅菌時(shí)間的變化2021/6/1626四路出汽：四路出汽：直接蒸汽直接蒸汽從排氣、接種、進(jìn)料從排氣、接種、進(jìn)料和消沫劑管排氣和消沫劑管排氣分批滅菌設(shè)備示意圖分批滅菌設(shè)備示意圖三

13、路進(jìn)汽：三路進(jìn)汽：直接蒸汽從直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間。這就是所一定的時(shí)間。這就是所謂的謂的“三路進(jìn)氣三路進(jìn)氣”。2021/6/1627（三）連續(xù)滅菌（三）連續(xù)滅菌（continuous sterilization） 1定義：將培養(yǎng)基通過(guò)專門設(shè)計(jì)的滅菌器，進(jìn)行連定義：將培養(yǎng)基通過(guò)專門設(shè)計(jì)的滅菌器，進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)滅菌后，進(jìn)入預(yù)先滅過(guò)菌的發(fā)酵罐中的滅菌續(xù)流動(dòng)滅菌后，進(jìn)入預(yù)先滅過(guò)菌的發(fā)酵罐中的滅菌方式。方式。 2流程：流程：1)由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng)由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng) 2)蒸汽直接

14、噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng)蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng) 3)由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng)由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng)2021/6/16281)由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng)工藝流程圖由熱交換器組成的滅菌系統(tǒng)工藝流程圖2021/6/1629溫度隨時(shí)間的變化溫度隨時(shí)間的變化2021/6/16302)蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng)蒸汽直接噴射型的連續(xù)滅菌系統(tǒng)2021/6/1631溫度隨滅菌時(shí)間的變化溫度隨滅菌時(shí)間的變化2021/6/16323)由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng)由連消塔、維持罐和噴淋冷卻組成的滅菌系統(tǒng)2021/6/1633（四）連續(xù)滅菌與分批滅菌的比較與選擇（四）連續(xù)

15、滅菌與分批滅菌的比較與選擇分批滅菌分批滅菌優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1. 不需附加設(shè)備不需附加設(shè)備2. 蒸汽利用率高蒸汽利用率高3. 節(jié)約勞動(dòng)力節(jié)約勞動(dòng)力缺點(diǎn)缺點(diǎn)1.培養(yǎng)基質(zhì)量比較差培養(yǎng)基質(zhì)量比較差2.罐的利用率低罐的利用率低3.冷卻水用量大冷卻水用量大 連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):1.采用高溫快速滅菌法采用高溫快速滅菌法2.可以把培養(yǎng)基按性質(zhì)分開(kāi)滅菌可以把培養(yǎng)基按性質(zhì)分開(kāi)滅菌3.有利于自動(dòng)控制有利于自動(dòng)控制4.節(jié)省冷卻水節(jié)省冷卻水缺點(diǎn)缺點(diǎn) 1.投資費(fèi)用高投資費(fèi)用高2.對(duì)物料要求高對(duì)物料要求高2021/6/1634選擇原則：選擇原則：1 培養(yǎng)基成份（易降解成分、液化情況等培養(yǎng)基成份（易降解成分、液化情況等 )

16、2 設(shè)備狀況（冷卻面積、傳動(dòng)裝置等）設(shè)備狀況（冷卻面積、傳動(dòng)裝置等） 3. 動(dòng)力條件動(dòng)力條件 2021/6/1635(五)、發(fā)酵罐的滅菌n培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法。則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個(gè)容器后，空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個(gè)容器后，再?gòu)呐艢夤苤芯従徟懦?。容器?nèi)的蒸汽壓力再?gòu)呐艢夤苤芯従徟懦觥Ｈ萜鲀?nèi)的蒸汽壓力保持保持1公斤，公斤，20分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵分鐘。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨

17、即通入無(wú)菌空氣，使容器保持正壓，防是隨即通入無(wú)菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。止形成真空而吸入帶菌的空氣。2021/6/1636(六)、補(bǔ)料液的滅菌n在發(fā)酵過(guò)程中，往往要向發(fā)酵罐中補(bǔ)入各種不在發(fā)酵過(guò)程中，往往要向發(fā)酵罐中補(bǔ)入各種不同的料液。這些料液都必需經(jīng)過(guò)滅菌。同的料液。這些料液都必需經(jīng)過(guò)滅菌。n滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補(bǔ)料速率滅菌的方法則視料液的性質(zhì)、體積和補(bǔ)料速率而定。而定。n如果補(bǔ)料量較大，而具有連續(xù)性時(shí)，則采用連如果補(bǔ)料量較大，而具有連續(xù)性時(shí)，則采用連續(xù)滅菌較為合適。續(xù)滅菌較為合適。n也有利用過(guò)濾法對(duì)另補(bǔ)料液進(jìn)行除菌。也有利用過(guò)濾法對(duì)另補(bǔ)料液進(jìn)行除菌。n補(bǔ)料液的分批滅菌，通常是向盛有物料的容器補(bǔ)料液的分批滅菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。中直接通入蒸汽。n所有的附屬設(shè)備和管道都要經(jīng)過(guò)滅菌。所有的附屬設(shè)備和管道都要經(jīng)過(guò)滅菌。2021/6/1637四、高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止四、高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止2021/6/1638消除高溫有害影響的措施消除高溫有害影響的措施 (1 (1）采用特殊加熱滅菌法）采用特殊加熱滅菌法(