常用生物軟件軟件及引物設(shè)計總結(jié)

1、常用生物軟件及使用概述常用生物軟件及使用概述也許不必將它當成您的研究領(lǐng)域但您最好知道如何使用這個工具 管理實驗室數(shù)據(jù)及文獻資料管理實驗室數(shù)據(jù)及文獻資料實驗室結(jié)果的儲存，管理和申報工作。Endnote分析和處理實驗數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)分析和處理實驗數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù) 隨著實驗的進行，就必須對實驗過程中的隨著實驗的進行，就必須對實驗過程中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的信息進行各種處理，包括和蛋白質(zhì)的信息進行各種處理，包括限制酶分析、引物設(shè)計、同源序列比較、質(zhì)粒作限制酶分析、引物設(shè)計、同源序列比較、質(zhì)粒作圖、結(jié)構(gòu)域圖、結(jié)構(gòu)域(motif)查找、查找、RNA二級結(jié)構(gòu)預測、蛋二級結(jié)構(gòu)預測、蛋白二級結(jié)構(gòu)分析、三維結(jié)構(gòu)顯

2、示等方面的內(nèi)容。白二級結(jié)構(gòu)分析、三維結(jié)構(gòu)顯示等方面的內(nèi)容。1、限制酶分析、限制酶分析 推薦軟件： DNAssist 1.0 DNAssist 1.0 大多軟件只對線性序列進行分析，那么cNNNNN NNNgaatt環(huán)狀的序列就找不到EcoR I的位點，DNAssist 1.0能很容易把這個EcoR I位點找出來。 另外DNAssist在輸出上非常完美，除了圖形、線性顯示外，還有類似DNASIS的列表方式，列出所有的位點（按酶排列，按堿基順序排列） 另外，Vector NTI 亦是一選擇2、引物設(shè)計、引物設(shè)計 Oligo 6 （引物評價）* Primer Premier （自動搜索）* Vect

3、or NTI Suit （綜合分析） Primer Express(實時定量PCR引物和探針設(shè)計) Omiga Dnastar Primer3 （在線服務(wù)）*3、同源序列比較、同源序列比較 NCBI的BLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector NTI Omiga，Bioxm ，LaserGene，pcgene等4、質(zhì)粒作圖質(zhì)粒作圖 Gene Construction KitGene Construction Kit WinPlas 2.7 Plasmid Premier2.02Plasmid Premier2.02 Plasmid

4、Toolkit5、結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(motif)查找查找推薦軟件：Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0的結(jié)構(gòu)域查找功能與它的引物設(shè)計一樣強，結(jié)果能以圖形、表格、序列三種方式輸出。同時還提供了一些未知的結(jié)構(gòu)域的列表；當然軟件本身也提供了大量的已知結(jié)構(gòu)域的序列。 6、RNA二級結(jié)構(gòu)預測二級結(jié)構(gòu)預測 RNAdraw RNAStructure 7、 蛋白分析蛋白分析 軟件 二級結(jié)構(gòu)分析二級結(jié)構(gòu)分析 ：Antheprot 4.5 三維結(jié)構(gòu)顯示三維結(jié)構(gòu)顯示 ：RasMol Cn3D 8、 格式轉(zhuǎn)換 各種軟件為了自己軟件的需要有不同的格式，對我們使用數(shù)據(jù)帶來了困難；格式轉(zhuǎn)換

5、軟件能幫助用戶解決這一問題。 推薦軟件：Seqverter 1.3 使用簡單，填寫輸入文件和輸出文件名就可以完成格式轉(zhuǎn)換。而且能夠轉(zhuǎn)換的格式非常之多是其它軟件所無法比擬的。另外，它可在線升級以讀寫更多格式文件。 9、 電泳圖譜分析 推薦軟件：band leader 3.0 提供處理DNA或蛋白分子凝膠電泳圖象和從凝膠電泳圖象獲得相關(guān)數(shù)據(jù)的工具。它可以對電泳圖譜進行半定量分析，識別掃描得到的WINDOWS圖象格式 .BMP，是一個難得的好軟件。10、序列綜合分析軟件 pcgene BioEdit LaserGene DNASIS DNATools DNAclub Jellyfish Omiga

6、Vector NTI Suite （Bioxm）Sense primerAntisense primer選擇模板序列保守區(qū)域選擇模板序列保守區(qū)域1、引物設(shè)計原則 引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結(jié)構(gòu) 引物3端 引物5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 自由能分布概述 引物長度 一般引物的長度為一般引物的長度為15-30 15-30 bpbp，常用的長度為常用的長度為18-2118-21bpbp。過長或過短都不合適，為過長會導致其延伸溫度大于過長或過短都不合適，為過長會導致其延伸溫度大于7474，不適于，不適于Taq DNATaq DNA聚合酶進行反應，長度大于聚合酶進行反應，長度大于24 24

7、核苷的引物并不意味著更高的特異性，而且比短序列核苷的引物并不意味著更高的特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。引物過短會引起錯配現(xiàn)象，雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。引物過短會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于一般來說引物長度大于1616bpbp是必要的（是必要的（18bp的序列在的序列在人類基因組中只會出現(xiàn)一次）。人類基因組中只會出現(xiàn)一次）。決定引物退火溫度（決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度值）最重要的因素就是引物的長度Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應超過5個 GC含量一般40-60%，以45-55為宜 GC含量太低導致引物Tm值較

8、低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。堿基分布的均衡性有一些模板本身的有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍含量不能在上述范圍內(nèi)，這時應盡量使上下游引物的內(nèi)，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及含量以及Tm 值保持接近值保持接近（上下游引物的（上下游引物的GC含量不能相差太大）含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。，以有利于退火溫度的選擇。引物Tm值 一般要求：55-65。 應盡可能保證上下游引物Tm值一致，一般差異控制在2 以內(nèi)。 （引物的退火溫度相差小于引物的退火溫度相差小于5一般

9、不會影響一般不會影響PCR的產(chǎn)率，理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在的產(chǎn)率，理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在5580間變化，有說接近間變化，有說接近72為最佳為最佳） 上下游引物Tm值與產(chǎn)物Tm值一般應控制在20 以內(nèi)。 一般采用較低引物Tm值-5作為PCR退火溫度。一對引物的一對引物的GC含量和含量和Tm值應該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的值應該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴重的GC傾向或傾向或AT傾向則可以傾向則可以在引物在引物5端加適量的端加適量的A、T或或G、C尾巴。若尾巴。若G+C含量太低，可在含量太低，可在5端加上一些端加上一些G或或C，若若GC含量太高，可在含量太高，可在5

10、端加上一些端加上一些A或或T。引物二級結(jié)構(gòu) 引物二聚體（引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性 ） 盡可能避免兩個引物分子之間3端有有較多堿基互補 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp ） 尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。（兩項結(jié)構(gòu)的能值以不超過兩項結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好，引物中間或為好，引物中間或5 5端可適當放寬端可適當放寬）兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于般情況下，一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基

11、的同源性或互補性。個連續(xù)堿基的同源性或互補性。引物3端 引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗。 引物引物3端的堿基一般不用端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好是端堿基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物間。另外引物間3端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致構(gòu)也可能導致PCR反應失敗。反應失敗。3端的連續(xù)端的連續(xù)3 3個個G 或或C ，如如GGG或或CCC，會導致引物在會導致引物在G+CG+C富富集序列區(qū)錯誤引發(fā)集序列區(qū)錯誤引發(fā)引物5端 引物5端可以有與模板DNA不配對堿基

12、（對對PCR 影響不大）影響不大），常在5端引入修飾位點或標記物。 5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5端加上適當數(shù)量的保護堿基）。 5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。 5端標記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。雙酶切位點，有利于定向克隆，2-3個保護堿基，一般加CG。計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 過去認為，引物3端應牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進行延伸，故3端最好為G或C。 現(xiàn)在的觀點認為，引物的5端應是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3端

13、盡可能選用A或T（有說不適宜用A），少用G或C。 若模板不很清楚，引物若模板不很清楚，引物3端最后一個堿基最好為端最后一個堿基最好為T，其次其次是是G或或C，而不選而不選A，國外資料表明，當末位為國外資料表明，當末位為T時，即使在錯時，即使在錯配的情況下也能引發(fā)鏈的合成，而末位為配的情況下也能引發(fā)鏈的合成，而末位為A時，錯配時引發(fā)大時，錯配時引發(fā)大大降低，大降低，G G或或C居中，可見，模板很清楚時選居中，可見，模板很清楚時選A可以提高特異性可以提高特異性。自由能分布G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性（結(jié)合的強弱程度結(jié)合的強弱程度）。一般情況下，一

14、般情況下，引物的引物的GG值最好呈正弦曲線形狀，即值最好呈正弦曲線形狀，即5 5端和中端和中間間GG值較高，而值較高，而3 3端端GG值相對較低，且不要超過值相對較低，且不要超過9 9 （絕對值，一般考慮末端5個堿基的G。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發(fā)。因此在復雜模板的擴增體系中，3末端5聚體的G應大于-9.0kcal/mol） ，如此則有利于正確引發(fā)反應而可防止錯，如此則有利于正確引發(fā)反應而可防止錯誤引發(fā)。誤引發(fā)。引物的3端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應。（能值越高越容易結(jié)合）33末端雙鏈的末端雙鏈的

15、GG是是0 02 2 kcal/molkcal/mol時，時，PCRPCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在6 6時只有時只有40%40%、到、到8 8時少于時少于20%20%、而、而1010時接近于時接近于0 0。引發(fā)效率（引物唯一性） 選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列 好的設(shè)計工具會提供一個引物異位引發(fā)的評價指標，好的設(shè)計工具會提供一個引物異位引發(fā)的評價指標，如如Oligo 6.0 Oligo 6.0 的的false priming efficiencyfalse priming effici

16、ency，即異位引發(fā)即異位引發(fā)效率，這個值是由程序根據(jù)引物自身二級結(jié)構(gòu)的能量、錯效率，這個值是由程序根據(jù)引物自身二級結(jié)構(gòu)的能量、錯配的類型、錯配離配的類型、錯配離33末端的距離等因素綜合計算而得出，末端的距離等因素綜合計算而得出，當此值大于當此值大于200200時便很有可能引發(fā)擴增。如所用工具無量時便很有可能引發(fā)擴增。如所用工具無量化指標，則可依據(jù)經(jīng)驗，當引物與模板在非預期位置退火，化指標，則可依據(jù)經(jīng)驗，當引物與模板在非預期位置退火，超過超過70%70%的堿基能互補配對，或引物的堿基能互補配對，或引物3 3末端連續(xù)末端連續(xù)8 8個或以個或以上堿基配對，則認為有引發(fā)的可能。上堿基配對，則認為有引

17、發(fā)的可能。2、具體引物設(shè)計過程 一般引物設(shè)計一般引物設(shè)計 測序引物設(shè)計測序引物設(shè)計 5端引入限制性內(nèi)切酶位點或標記引物設(shè)端引入限制性內(nèi)切酶位點或標記引物設(shè)計計 簡并引物設(shè)計簡并引物設(shè)計 特殊需求引物設(shè)計特殊需求引物設(shè)計參數(shù)設(shè)置默認引物長度 - 默認值為25引物對搜索最大值 - 默認值為100核酸濃度 -默認值為250 pM單價離子濃度 - 默認值為50 mM游離Mg2+離子濃度 - 默認值為1.5 mM評分參數(shù)Rating parameters 評分參數(shù)窗口是用來設(shè)定二級結(jié)構(gòu)在引物評分中的權(quán)重系數(shù)二級結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定引物評分就會越低相對于在引物中間形成的二級結(jié)構(gòu)來說3 末端的二級結(jié)構(gòu)對PCR擴增的影

18、響會更大為了將這一效應計算在內(nèi)軟件將3 末端的二級結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值G減去1 這一修正會使3 末端的二級結(jié)構(gòu)顯得更加穩(wěn)定參數(shù)設(shè)置序列獲取及同源性比較比對軟件和方式多，這里演示下Omiga，和primer載入序列Preimer Premier 啟動界面Load sequence粘貼序列窗口這一窗口使得一段核酸序列通過選擇以四種不同的方式粘貼上去（CTRL-V）基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function 引物設(shè)計界面First yo