實驗七--苯硫脲嘗味的群體遺傳學(xué)調(diào)查

1、實驗七苯硫服嘗味的群體遺傳學(xué)調(diào)查一、實驗?zāi)康腖測定人群中PTC嘗味基因的表現(xiàn)型和基因型，理解孟德爾遺傳基因型與表現(xiàn)型的對 應(yīng)關(guān)系。2. 了解酶切擴增多態(tài)序列（又稱為PCR-RFLP）技術(shù)的原理，學(xué)會用PCR-RFLP技術(shù)檢測 單核甘酸多態(tài)性（SNPs）0在分子水平上測定PTC嘗味的基因型。二、實驗原理苯硫腺（phenylthiocarbamide, PTC）是硫眼的苯基衍生物，為白色結(jié)晶粉末，因 含有硫代酰胺基（N-C=S）官能團而有苦澀味。能嘗出1/750, 000-1/50, 000 PTC濃度溶液 味道的人（苦澀味，少數(shù)人感到甜味）稱為苯硫肥“嘗味者”，只能嘗出PTC濃度大于 1/24,

2、 000溶液的味道的人稱為苯硫服“味盲者（nontaster） ”。PTC嘗味能力是受單基因控制的孟德爾遺傳性狀，是由位于7號染色體上的一種苦 味味覺感受器基因TAS2R38決定的，屬于常染色體不完全顯性遺傳。嘗味者中顯性基因 T的純合子（TT）能嘗出1 /750,000-1 / 6,000,000的PTC溶液的苦味,雜合子（Tt）只能 嘗出1 / 480, 000-1 / 380, 000的PTC溶液的苦味。人類的PTC嘗味基因又名PTC、T2R38或T2R61。絕大多數(shù)嘗味者與味盲者的區(qū) 別在于三處單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）

3、： 一處是145位， 味盲者為G145 （編碼丙紈酸ala）,嘗味者為C145 （編碼肺經(jīng)酸pro）：第二處是785位, 味盲者為T785 （編碼級皴酸val ）,嘗味者為C785 （編碼丙額酸ala）：第三處 在886位, 味盲者為A886 （編碼異亮緞酸ile）,嘗味 者為G886 （編碼繳氨酸val）。因此味盲者PTC 多肽中三處對應(yīng)的疆基酸分別是ala49、val262和ile262,被稱為AVI等位基因，而嘗 味者的三處是pro49、ala262和val262,被稱為PAV等位基因。如圖1所示。三個SNP位點；SNP1SNP2SNP3等位基因味盲者GCACTGTTGCATCCTG14

4、5 (ala49)丁785(val262)A886 (ile296)AVI嘗味者C145 (pro)C785(a|a)G886 (val)PAVCCACTGQTGCGTCCTFnu4Hl識別位點（識別序列5：GC1NGC3）味盲者的PTC編碼區(qū)有五個限制性切幅Fnu4Hl的識別位點(識別序列 5' -GCIXGC3'),如果是嘗味者，則其第785位SNP恰好形成了一個額外的Fnu4Hl識 別位點(GCTGC)o因此可以利用這個SNP造成的限制性位點多態(tài)性，設(shè)計引物擴增包含 785位SNP位點的PTC Fnu4Hl基因編碼區(qū)的一部分，然后用Fnu4Hl切割擴增產(chǎn)物，根 據(jù)是否能把

5、擴增產(chǎn)物切開而判定是某個人的單倍型(haplotype)0如圖2所示。GO20tgt tgactc tctcgcatccgcactgtg tcctatg.iagtcngg,-gt ac a t t t cig t tcatttcagtcc103UOt gg hg t t t gc ag t gggg t t tc tgaccaa tg cc t t eg t t t tc t t gg t gaa t t t t t gggaIgSNP多態(tài)位點icegcggc-ictg gcai«c«g t glFnu4H)119 4tLgc1 9tgic t cieo200gc i gg

6、a c t g22028c t g t t cc t gag t gc t a t cc ac t t acccacI g g t g a a c c actgaaccacagctaccaag320cca t ca teatgc t a t gg t ga t t gca anccc t ggc t tlFnu4Hllg ct gclc t g c c t c r340gee t gc t t t h360«)c t gc t cca gc t ca t ccg( tIc t c t cacacc t t cc t ga t c(get t ggca ac gg400400t c c

7、 t ggg t a tt cc t gca t c tgca c t g t cc t509520540上游引物gcagacctcac t t ca c g t cacactgtgctattcatgaac t gc t t c t gc t cc 11 t cc tGO690700gt t tettetggg&tgctg c tgtetccctggg ggcacat g ggacaatgaggtetat acc;g)aact723740700c t eg t gacccc geetggag gcccacrttaaagccctcaatcct tt ttet get tct t tgtg

8、 t t t g t g tt|gt g.igg g gcaga t t cccggSNP多態(tài)位點003020下游引物gcccc t uC t gd t t c I g t ggcgcgacld aaa t ggggtg：tg9 9am dgcLgk t tgtccct g t ga t gacc a t t c t g c t c t1.0Wacac t g t gc t gat c t ggg ca tgggc t c g竿Fl ：|g cgc|caFnu4H/<b efagde t tNP多態(tài)位點930tcct ga t c t caggc aatgccaagtgag 9tg ge

9、eg accacaaflgc圖2味盲者PTC嘗味基因編碼區(qū)序列三、實驗用品1. 人口腔上皮細(xì)胞總 DA、引物 I 和 H （20 口 M）,TaqDNAB（5U/ul）. 10XPCR 反應(yīng)緩沖液、dNTP （2.5mM）、火菌蒸儲水、限制性切酶Fm14Hl （20U/u 1）、10X酶切緩 沖液。2. 2%的瓊脂糖凝膠、1XTAE、6X上樣緩沖液、DNAMarker. Goldview染料。3. PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、微量加樣器（5 口 1、20 u 1、200四）、槍頭（20可、2001） 及離心管（1ml、0.5ml）、容器盒、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、燒杯、保鮮膜、封 口膜、微

10、波爐、250ml三角燒瓶、透明膠帶、托盤天平、臺式高速離心機。四、實驗步驟1 . 口腔上皮細(xì)胞總DNA的提?。?）每實驗小組選取1名受試者，用滅菌牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞。（2）在1.5 ml滅菌微量離心管中加入100 pL滅菌水。（3）受試者用無菌牙簽輕刮口腔腮側(cè)，刮下來的細(xì)胞在滅菌水中漂洗。（4）渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻10s。（5）離心機瞬時離心10s。（6）沸水浴中煮沸5 min。（7）離心機 13200rpm 離心 2 min。（8）基因組DNA¥C保存?zhèn)溆谩? .PCR擴增PTC基因片段，反應(yīng)體系如下：上游引物：hPTC Forward S'-aactggcagaata

11、aagatctcaatttat-B, 下游引物：hPTC Reverse 5aacacaaaccatcacccctatttt-B'«按以上次序，將各物質(zhì)加入到一只無菌的0.2ml離心管中。 輕輕混勻后，離心5秒鐘，加入一滴液體石蠟蓋于反應(yīng)混合液的表面，然后放入PCR儀 中進行循環(huán)反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序如下：94 5min（預(yù)變性）-94*C 30s（變性）-55c 30s（退火）-72c 30s（延伸）-step 1step 2step 3step 472 lOmin（延伸）-4 保存step 5step 6其中從step2到step4循環(huán)40次，PCR產(chǎn)物總長3O3bp,反應(yīng)

12、結(jié)束后置4冰箱保存。3 . PCR產(chǎn)物的Fnu4Hl酶切反應(yīng)體系15pl其成分如下:PCR產(chǎn)物6 u 1Fnu4Hl (lOU/ul)lul10X酶切緩沖液2 u 1無菌水6 u 1置37水浴消化1小時，4保存4 .瓊脂糖凝膠電泳檢測（1）膠板的準(zhǔn)備取有機玻璃槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機玻璃槽的兩端邊緣封好（注意，將透 明膠帶緊貼于有機玻璃槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機玻璃槽置于一水平位置，在 距離底板0. 51. 0ml的位置放入梳子。（2） 2%的瓊脂糖凝膠的制備稱取1克瓊脂糖，置于錐形瓶，加入50ml 1XTAE,瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐 中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到2%瓊脂糖

13、凝膠液，待其冷卻至65c左右，加入2.5瓜 澳化乙噬貯存液（10mg/ml）,使澳化乙噬終濃度為0.5卜嗚%11。小心混勻并倒在有機玻璃 槽中，控制港膠速度，使膠液緩慢展開，避免產(chǎn)生氣泡，直到在整個有機玻璃板表面形成 均勻的膠層。室溫下靜置1小時左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成 相互隔開的樣品槽。（3）將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預(yù)電泳 lOmin-（4）每份限制酶切產(chǎn)物取10可，加2詛6X上樣緩沖液，混勻后加入到樣品孔中， 以100V電泳50分鐘。（5）斷電后取出凝膠，放在紫外透射儀中觀察并記錄PCR-RFLP結(jié)果。電泳結(jié)果中基因型為TT的嘗味者能夠出現(xiàn)2條酶切條帶，基因型為Tt的嘗味者能夠出現(xiàn)3條酶切條帶，基因型為tt的味盲者能夠出現(xiàn)1條酶切條帶，如圖3,4所示。TT238