如何通過伽馬輻射提高免疫測定靈敏度：抗HIV—1酶聯(lián)免疫吸附測定中的聚苯乙烯表面的改性、應用及表征

1、如何通過伽馬輻射提高免疫測 定靈敏度：抗HIV 1酶聯(lián)免疫 吸附測定中的聚苯乙烯表面的 改性、應用及表征如何通過伽馬輻射提高免疫測定靈敏度：抗HIV 1酶聯(lián)免疫吸附測定中的聚苯乙烯表面的改性、應用及表征摘要：經(jīng)60CO射線輻射的改性聚苯乙烯（PS）微量滴定板用于 間接酶聯(lián)免疫測定抗人類免疫缺陷病毒 1型（抗HIV 1）。用9 kGy（最佳劑量）輻射過的板在血清學診斷試驗中表現(xiàn)出比未處理組高2一5倍的檢測靈敏度，并且比控制組低 3倍的酶濃度仍是可檢測的。 吸附/解析實驗結果、原子力顯微鏡（AFM ）圖像和X一射線光電子 能譜（XPS）分析為這種性能提升提供了證據(jù)。在輻射期間形成的氧 化表面對包被

2、抗原呈現(xiàn)出更高的結合親和力，并能均勻地吸附更大量（1.5 3倍）的蛋白質(zhì)。關鍵字：ELISA,廣射線車1射，HIV1,聚苯乙烯表面，蛋白吸附前言PS微量滴定板常作為酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA ）中蛋白質(zhì)吸 附的固相載體，現(xiàn)在作為一種成熟的技術已被廣泛應用于生物科學和 醫(yī)學實驗室診斷。由于這種檢測方法是基于固相免疫反應， 所以生物 活性化合物對板的吸附是非常重要的。 然而，由于小分子幾乎沒有結 合位點，所以低分子量的抗原/抗體很難通過隨機吸附固定在PS表面。PS表面和小分子蛋白的弱相互作用限制了 ELISA測定法的靈敏度。 通常，在PS表面這種類型的固定要涉及共價偶聯(lián)步驟，因蛋白質(zhì)不 適當?shù)臉?/p>

3、象呈遞和定向，這是耗時的并且可能改變抗原表位。 為了保 持它們的構象和生物活性，不同的方法，如生物素一鏈霉抗生素蛋白 橋和親和配體已被用于定向固定化。 在這項研究中，我們用一定劑量 的60CO1射線車g射了 PS微量滴定板，并將這改性的板用于低分子 量的HIV 1重組抗原（分子量：32kDa）的吸附。我們通過在一個 典型的間接ELISA測定系統(tǒng)中檢測抗HIV-1評估了車!射對PS板的 性能效果。此外，吸附/解析實驗、AFM和XPS被用來進一步研究 蛋白質(zhì)在PS表面的吸附。試驗輻射處理在3 m3/min的空氣流速下，PS 96孔微量滴定板（Nunc,丹麥） 被60CO源（福建農(nóng)業(yè)科學研究院，中國

4、）在劑量率為 1 kGy/h下， 分別以0、3、6、9、12、15 kGy的水平進行輻射。ELISA研究步驟在輻射之后，用pH為7.2, 10 mL的磷酸緩沖液（PBS）稀釋 HIV1重組抗原（gp 120gp41,賈大勇博士友情提供），然后以 100 uL/孔加入ELISA平板中，在4 c過夜（這個過程通常為包被）。 接著，用含0.05% （v/v）的Tween20的PBS溶液洗滌板，并用封 閉劑（含2.5 mg/mL BSA的PBS）在37 C下封閉2 h。在板的每個 孔中加入100 uL稀釋的血清樣品（含有抗HIV 1抗體的陽性樣品， 來自全國臨床檢驗中心，中國）。在37 C下經(jīng)過0.5

5、 h的孵育后將板 洗滌，然后加入適宜濃度的辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗人IgG （HRP一IgG, Sigma,美國），接著再培養(yǎng)0.5 h。各孔再次洗滌以除去任何未結合的鈍合物，接著再加四甲基聯(lián)苯胺（Sigma,美國）培養(yǎng)15 min。加入50 uL的2 mol/L的硫酸終止比色反應，用550酶標儀（Bio 一 Rad,美國）在450 nm處檢測吸光值。所有實驗重復 4次，以吸 光值（OD450nm）的算術平均值計算。解析實驗在每個包被孔中加入 100 uL的pH為7,100 mmol/L KNO 3溶液， 在37 C下劇烈振動孵育2 ho收集該溶液后，解析的HIV 1抗原 量由溶液中蛋白質(zhì)濃度來

6、確定。解析實驗用99 mmol/L KNO 3-1mmol/L HNO3溶液（pH 值為 3）和 90 mmol/L KNO 310 mmol/L KOH溶液（pH值為12）重復進行。使用微BCA蛋白檢測試劑盒 （Pierce,美國）測定蛋白質(zhì)濃度。AFM 和 XPS在封閉之前，包被板的孔底可用 AFM和XPS測量。AFM用的 是接觸式Nanoscope Hla型多模式掃描探針顯微鏡（數(shù)字化儀，美 國）。XPS測定是用SSX100分光儀（表面科學儀器，美國）結合 單色化的AlK a X射線源（能量為1486.6 eV）在150 W條件下運行。結果與討論免疫測定特性各種劑量輻射的效果通過 ELI

7、SA靈敏度進行評估。表1表明吸 光度值隨著輻射劑量的增加而逐漸增加，最大輻射劑量為9 kGy,更大劑量的輻射會讓吸光值降低到一定程度。與未處理組相比，經(jīng)kGy輻射的板在抗HIV 1系列稀釋液（446倍）中（圖1a）或包 被濃度的一個寬的范圍內(nèi)（0.1-1000 ug/mL）（圖1b）都表現(xiàn)出2 一5倍更高的檢測靈敏度。表1示出使用經(jīng)9 kGy輻射過的板ELISA 的信噪比（信噪比，陽性樣本吸光度的平均值與陰性樣本吸光度的平 均值的差值除以陰性樣本吸光度值得到的百分比）高達25.9,比控制組低3倍濃度的HRP-IgG溶液仍然是可檢測的。相反，使用未經(jīng) 處理板的 信噪比分析比較差，分別用1:240

8、0和1:800稀釋HRPIgG 時，只有7.7和6.5。圖2表示在9 kGy輻射板上的蛋白質(zhì)吸附比未 經(jīng)處理的要吸附得更快并更早地達到平衡態(tài)。吸附/解析行為為了確定是主要由于改型表面吸附能力的增加還是由于包被抗 原更好的構象呈遞提高了 ELISA檢測的靈敏度，已被包被抗原包被 的未處理板和9 kGy輻射板與辣根過氧化物酶標記的兔抗HIV1（兔多克隆抗體，通過將HIV1重組抗原注射到兔子里產(chǎn)生） 在一 個直接的ELISA系統(tǒng)（這里名為吸附實驗）反應。如果ELISA靈敏 度的提高主要是由于改性表面吸附能力的增加而不是包被抗原更好 的構象呈遞，使用輻射板的直接 ELISA系統(tǒng)的吸光值應該會增減， 因

9、為多克隆抗體無論包被抗原有什么樣的構象，都能識別它們。結果發(fā)現(xiàn)，吸附實驗中所有包被濃度測定（8、40和200 ug/mL）,使用9 kGy輻射板的直接ELISA的吸光值比未處理組的大 2-4倍。從這 個實驗得到的結論和下文的 XPS結果一致?？笻IV1ELISA測定系統(tǒng)中的PS表面通過解析實驗評估了包被的穩(wěn)定性。當包被濃度為40 ug/mL時， 吸附在經(jīng)9 kGy輻射表面的HIV1抗原不能被pH為7的100 mmol/L KNO 3溶液或者 pH 為 12 的 90 mmol/L KNO310 mmol/L KOH混合溶液去除。然而吸附在未經(jīng)處理表面的HIV -1抗原卻能在同樣條件下被去除11

10、%和29%。在pH為3時，大約6%/48%包 被在經(jīng)輻射過/未輻射過的板上的包被抗原被從 PS表面去除。從其它 包被濃度實驗中獲得類似結果。止匕外，結果發(fā)現(xiàn)，抗原在包被過程中 通過共存的表面活性劑和鹽幾乎能不受干擾地吸附在改性表面，甚至加入5% （v/v） Tween20和0.5 mol/L NaCl后也沒有觀察到明顯的 免疫反應性損失。這些結果表明，與未處理板相比，抗原優(yōu)先吸附在 輻射過的板上而且在很寬的pH范圍內(nèi)不易解析。表面表征為了探討輻射板性能的改進，表面特性通過 AFM和XPS進行 檢測。包被板的表面形貌通過 AFM測定，示于圖3.HIV1抗原表 現(xiàn)為大約寬0.1 um,高0.05

11、um,平均間距0.15 um的聚合物。相比， 改性后的表面，未處理板上的抗原分布是不均勻的， 有些區(qū)域完全沒 有。這似乎是未處理板和經(jīng)9 kGy輻射板的變異系數(shù)（CV,見表1） 和ELISA檢測靈敏度有所差異的主要原因。在蛋白質(zhì)吸附前，在PS表面的XPS分析中只檢測到碳和氧。未 處理板含有1.7%的氧（可能來自添加劑和滅菌處理），在用最佳輻射 劑量9 kGy輻射后，含量上升到13.1%,表明其中可能包括羥基、?；?、竣基等含氧基團的發(fā)展。因此，在輻射過程中表面氧化因親水性也有相應的提高，所以可能是改性板性能提高的主要原因。在HIV 一1抗原包被后，固定在PS表面的蛋白質(zhì)總量能通過 XPS檢測到的N總量推斷出（蛋白質(zhì)的平均含氮量約為 16%）。由圖4可看出，在 所有包被濃度試驗（1.61000 ug/mL）中，在經(jīng)9 kGy輻射過的板上吸附的蛋白質(zhì)總量大約比未處理板上吸附的蛋白質(zhì)總量多1.53倍。這和以上提到的ELISA結果一致，并表明經(jīng)適當劑量 60CO輻 射預處理的PS板確實表現(xiàn)出對包被蛋白更好的親和力。結論低分子量的HIV1重組抗原能夠被經(jīng)9 kGy （最佳劑