細菌RpoN蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能初探

1、細菌RpoN蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能初探細菌RpoN蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能初探本文關(guān)鍵詞：初探，細菌，蛋 白，功能，發(fā)現(xiàn)細菌RpoN蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能初探本文簡介：摘要：RpoN蛋白 是RNA聚合酶的一種。因子，隨著近年來對于RpoN基因功能的探索, 其多種功能被發(fā)現(xiàn)，如脅迫應答、調(diào)控措施氮源及碳源的利用、調(diào)控 細菌防護力及毒力等。本文對不同種屬細菌中RpoN基因的功能成功進 行整理，力圖為深入研究不同細菌RpoN蛋白介面奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：RpoN蛋白；轉(zhuǎn)細菌RpoN蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能初探本文內(nèi)容：摘 要：RpoN蛋白是RNA聚合酶的一種。因子，隨著近年 來對于RpoN基因功能的探索，其多種功能被發(fā)現(xiàn)，如脅迫應

2、答、調(diào)控 措施氮源及碳源的利用、調(diào)控細菌運動性及毒力等。本文對相異種屬 細菌中RpoN基因的特性進行整理，旨在為深入研究不同細菌RpoX受 體功能奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：RpoN蛋白；轉(zhuǎn)錄；表達調(diào)控；Abstract： RpoN protein is a sigma factor of RNA polymerase. In recent years, many functions were found with the exploration ofrpoN gene faction.Such as forced response, regulate and control the use of ni

3、trogen source and carbon source, regulation of bacterial motility and virulence. In this paper, to organize the function of RpoN genes in different species of bacteria. It's aims to lay a foundation for further study of the function of different bacterial RpoN proteins and control of bacterial d

4、iseases.Keyword： RpoN protein; Transcription; Express regulation;RpoN是。家族的唯一成員，最早在肺炎克雷伯氏菌中克隆得 到，隨后在固氮菌、根瘤菌、紅細菌以及假單胞菌中也克隆到了類似 序列，起初的研究認為RpoN僅僅與氮排泄相關(guān)，但后續(xù)的研究表明其 還與逆迫應答、碳源的利用、運動及毒力等基因表達相關(guān)。近年來有 關(guān)RpoN的研究報道急速增多，它能夠調(diào)控多個功能基因的轉(zhuǎn)錄與表達, 在很多許多細菌中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。1、。因子簡介轉(zhuǎn)錄是生物合成的必要步驟，由多種蛋白共同作用，RNA聚合 酶是該過程的重要蛋白，多肽全酶包括核心酶(a2

5、B (T )和。因子 兩大部分，大多數(shù)。因子是一類相對較小的蛋白家族，它們通過可逆 地與聚合酶的核心酶結(jié)合并參與積極參與識別啟動子。在轉(zhuǎn)錄的過程 中，。因子作為一種多肽不與DNA結(jié)合，RNA聚合酶全酶與啟動子結(jié) 合時可產(chǎn)生較牢固的激酶，在的位置又可轉(zhuǎn)變?yōu)檩^疏松的復合物。當 全酶與。因子分開后，核心酶沿著DNA鏈移動進行延伸，以此進行轉(zhuǎn) 錄。原核生物可通過。因子選擇性的與啟動子結(jié)合從而進行自身。根 據(jù)數(shù)組的功能相似程度以及功能的差異，可將。家族分為。70 (RpoD、 RpoS、RpoH等)和。54 (RpoN)家族，。70在一般細菌中主要負責 管家基因的調(diào)控；。54 (RpoN)控制一套多元化

6、全套基因的轉(zhuǎn)錄，能 調(diào)控很多不同基因的轉(zhuǎn)錄與表達。且不同。因子之間存在共振。RpoN是。54家族中唯一的領(lǐng)導者，在不同細菌中具有相似性。 基于序列相似性的特點可將其分為3個區(qū)域：區(qū)域1由25-50個氨基 酸構(gòu)成a 2螺旋，富含Leu和Gin；區(qū)域2為可變區(qū)域，包含60-110 個氨基酸序列，多數(shù)為酸性氨基酸殘基；區(qū)域3是序列的梭基端，大約含有400個殘基，這個區(qū)域又包含三種典型的構(gòu)象X-LIXK構(gòu)象、HTH構(gòu)象和完全保守區(qū)的RpoXBOX （含有10個保守的氨基酸側(cè)鏈）1K2、RpoN的發(fā)現(xiàn)及功能初探對于RpoN的研究最早見于1985年，Merrick和Gibbins在肺 炎克雷伯氏菌中克隆到

7、rpoN基因。隨后，在固氮菌、根瘤菌、紅細菌 以及假單胞菌中也克隆到了類似序列。起初的研究認為RpoN僅僅與氮 代謝相關(guān)，但先期的研究表明RpoN可調(diào)控多種生物學特性。2. 1、RpoN在氮源調(diào)控措施的研究自rpoN基因首次正式進入學者的視線中，其在氮新陳代謝代 謝的功能最早被發(fā)現(xiàn)。一般來說，細菌中的氮循環(huán)過氧化氫都需要經(jīng) 過氨氧化、同化以及硝化的整個過程，當形成NH4+才能可以參與細菌 的生命活動，供菌體利用。研究報道，RpoN的缺失會導致細菌對缺位 氮源利用能力的減弱甚至喪失。對大腸桿菌中rpoN基因進行敲除，缺 失株與野生株相比較，NH4cl利用能力明顯下降；而丁香假單胞菌 rpoN缺失

8、株則無法利用氮源生長，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在綠膿桿菌的 rpoN缺失株的研究中2 o2. 2、RpoN在碳源調(diào)控措施的研究對RpoN的研究最初見于細菌氮源同化上，但隨著研究深入發(fā) 現(xiàn)它在碳源調(diào)控中也扮演重要角色。在惡臭假單胞菌中，由于其生活 情形較為復雜，有數(shù)種可被利用的碳源，當rpoN被缺失，其雖然可以 在以為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長，竟卻不能在以苯乙酸為唯一碳 源的培養(yǎng)基中生長，而野生菌株卻可以在兩種碳源中均可生長，其通 過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯通透性酶編碼基因paal無法在rpoN缺失 株中表達，產(chǎn)生所謂消除的碳代謝抑制現(xiàn)象。除了直接排泄調(diào)控某些 碳代謝途徑的關(guān)鍵酶外，RpoN不但通

9、過調(diào)控非編碼RNA參與多種碳源 的利用過程：丁香假消息單胞菌中存在CrcX參與碳調(diào)控過程；在綠膿 桿菌中，還存在一個雙組分系統(tǒng)CbrAB與RpoN共同調(diào)控crcZ、crcY 的表達量從而影響碳代謝過程，綠膿桿菌rpoN缺失株中crcZ和crcY 表達量下降5。進一步研究發(fā)現(xiàn)缺少在其缺失株中仍能檢測到crcZ. crcY的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，只是五個這兩個基因的轉(zhuǎn)錄受到RpoN的影響。2.3、 調(diào)節(jié)真菌運動能力2.3、 、1參與細菌的剛毛合成過程運動是細菌趨化以及定殖的關(guān)鍵，細菌的重要運動器官是微 生物鞭毛，不同菌株的鞭毛合成演化過程每種類似，但其調(diào)控機制卻 雖然存在很大差別。研究表明RpoN與細菌鞭毛的

10、形成以及調(diào)控細菌的 定殖存在一定關(guān)聯(lián)。據(jù)報道，在綠膿桿菌中，rpoN的缺失導致其對上 皮細胞的粘附力下降，通過電鏡觀察菌體完全喪失鞭毛結(jié)構(gòu)；在遲鈍 愛德華氏菌中，RpoN的缺失也顯著影響細菌的運動能力；在研究大腸 桿菌rpoN也能發(fā)現(xiàn)與棒狀的合成相關(guān)，控制著菌體的運動性，但并未 發(fā)現(xiàn)rpoN識別保守結(jié)合位點，推測rpoX通過FlhDC間接調(diào)控鞭毛調(diào) 節(jié)因子fliA的表達，或者rpoN與FliA共同調(diào)控鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄和表 達；通過透射電鏡觀察斯氏假單胞菌A1501rpoX缺失株發(fā)現(xiàn)缺失株無 鞭毛，又通過趨化觀察到該菌株喪失運動能力；由芯片技術(shù)尋獲綠膿 桿菌rpoN缺失株中50個鞭毛基因中有43個

11、基因的表達量發(fā)生較為明 顯變化。由此可見，RpoN在鞭毛基因的表達核酸調(diào)控中扮演重要角色。2.4、 2、參與菌毛合成投資過程細菌的菌毛屬性有：P菌毛、I型菌毛、IV菌毛等等，它與細 菌的黏附、運動以及致病性密切相關(guān)。Ramphal等研究發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌菌 毛合成受到RpoN的調(diào)控，同時RpoX的缺失導致其細胞壁黏附能力顯 著下降3；在長奈瑟球菌以及假單胞菌Rpo缺失株中均能菌毛的合 成及運動也會顯著下降4。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，很多噬菌體陰性菌RpoN 對菌毛合成過程的制約主要源于PilA的調(diào)控，PilA受RpoN和PilR- pilS共同調(diào)控，PilS接受旁人信號刺激后自身發(fā)生磷酸化，隨后磷酸 化Pil

12、R,磷酸化的PilR與RpoN共同激活PilA轉(zhuǎn)錄起始5,隨后 PilA通過翻譯、組裝、呈現(xiàn)出菌毛的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。2.4、 調(diào)控生物被膜合成及毒力相關(guān)細菌的胞外多糖被認為與該細菌毒力、生物被膜合成技能及 耐藥性有很大關(guān)系。相關(guān)研究表明，在遲鈍愛德華菌中所rpoN缺失能 導致生物被膜形成能力下降；在固氮施氏假單胞菌中rpoN的缺失卻導 致生物被膜形成本領(lǐng)喪失；但在鼠傷寒沙門氏菌中，rpoN缺失株卻導 致生物被膜形成能力增強，使細菌在不利條件下產(chǎn)生胞外聚合物黏附 在電磁輻射表面，以固著的方式逐步形成生物被膜，以便適應不利環(huán) 境。所以說RpoN是非常重要的壓力調(diào)控因子，這一發(fā)現(xiàn)為進一步研究 RpoN調(diào)控

13、生物被膜己經(jīng)形成機制奠定了基礎(chǔ)。細菌生物被膜存在于非 生物或生物表面，一直被認為與病原菌毒力密切相關(guān)，其可以為病原 菌抵抗不同的環(huán)境壓力、避免防空免疫系統(tǒng)清除以及來自宿主的各種 化學防御6, 7,因此對于細菌被膜的研究從某種意義上就是之上對其 毒力的研究。3、RpoN蛋白表達調(diào)控的研究3. 1、RpoN蛋白調(diào)控其他。因子表達在革蘭氏噬菌體中，。因子之間相互的級聯(lián)調(diào)控關(guān)系控制著 連續(xù)的基因表達；而在革蘭氏陰性菌中所，。因子控制著離散基因簇 的表達8。因子之間的相互作用使得不同的間壓力信號得以擴充從 而產(chǎn)生相互協(xié)調(diào)的基因應答。有試驗證實RpoN與RpoS之間存在拮抗 作用，雙缺失后在許多菌體中產(chǎn)生

14、形成了相反的效應：結(jié)果顯示比如 遲鈍愛德華氏菌中其基因芯片結(jié)果顯示RpoN調(diào)節(jié)子中60%受RpoS調(diào)控, RpoN的缺失對RpoS的表達具有正調(diào)控；。70家族蛋白FliA受RpoN 的正調(diào)控；在大腸桿菌中。因子之間復雜的限于調(diào)控關(guān)系涉及到菌體 運動性、氮源利用、壓力調(diào)控措施以及其他細胞功能9。試驗發(fā)現(xiàn)。 因子的相互作用是依賴于。因子之間的糖分相對含量以及它們對RXA 聚合酶核心酶的親和力。除此之外，相關(guān)研究表明，在鼠傷寒沙門氏 菌中rpoN、rpoE rpoH rpoS、rpoD等。因子在指數(shù)期和生物被膜 形成期的基因表達有差異10 o3.2、 控制rpoN轉(zhuǎn)錄的因子RpoN作為一個。因子，是

15、細菌轉(zhuǎn)錄主要水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個 重要組分，控制轉(zhuǎn)錄的因子主要有以下幾種：3.2.1、 c-di-GMPc-di-GMP是細菌體內(nèi)普遍存在的第二信使分子，它能夠激活 級聯(lián)系統(tǒng)中蛋白的活性，它可以瞬間升高、且能快速降低，并由此調(diào) 節(jié)細胞內(nèi)代謝系統(tǒng)的酶活性，控制細胞的肉體活動,包括:葡萄糖的攝 取量和利用、脂肪脂質(zhì)的儲存和移動以及肝細胞產(chǎn)物的分泌。第二信 使也控制著細胞的增殖、分化和生存，并參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。相關(guān)研 究表明，高濃度c-di-GMP調(diào)節(jié)生物膜的產(chǎn)生，低濃度c-di-GMP抑制 生物膜的產(chǎn)生。c-di-GMP控制生物膜胞外多糖編碼的固相產(chǎn)生，通過 Bcaml330-Bcaml341基因

16、推動細菌蛋白的強化。GMP與增強子結(jié)合調(diào)節(jié) 生物膜胞外多糖的穩(wěn)定并激活RpoN依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。c-di-GMP 作用的核開關(guān)是核最老發(fā)現(xiàn)的不參與代謝活動而參與信號傳導的目前 開關(guān)，其發(fā)現(xiàn)有利于解釋c-di-GMP生物學功能的多樣性。Fazli等研 究表明在洋蔥伯克霍爾德氏菌中rpoN專業(yè)知識的缺失株無生物膜合成 能力，通過激活編碼c-di-GMP后發(fā)現(xiàn)胞外多糖合成基因可在其中進行 表達，因此可推測是c-di-GMP是RpoN的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。但是對c-di- GMP的確切調(diào)控措施機制目前現(xiàn)今仍不十分清楚，還有待更深入的研 究11。3. 2. 2、RpoN的啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響啟動子為轉(zhuǎn)錄的起始

17、位點上游鄰近的功能區(qū)。RpoN啟動子的 保守區(qū)分布在起始位點上游的T2和-24位置。很多細菌的轉(zhuǎn)錄即使依 賴于RpoN啟動子，從而控制許多生物學特質(zhì)，如趨化性或運動性12。 在大腸桿菌中，有接近100個rpoN分子，但真正為rpoN依賴型啟動 子的數(shù)量卻不到20個；在鐵還原菌中，受到RpoN負調(diào)控的基因(如 fliL、fdnG、nifEN)啟動子區(qū)結(jié)合位點相對受正調(diào)控的基因(glnB> , dcuB)的位點更加保守，這些序列上才的差異可能導致RpoN對不同基 因的調(diào)控差異；還有實驗向非典型RpoN依賴型啟動子中核糖體人為引 入保守結(jié)合元件，可導致RpoN與啟動子結(jié)合能力增強。同時-12區(qū)

18、的GC含量變化也會導致潛能轉(zhuǎn)錄的能力的盡失。RpoN啟動子參與調(diào)控多 種代謝過程，苯甲酸和二甲苯的降解、二竣酸的輸送、菌毛蛋白的合 成、氮固定、氫攝取、鞭毛組裝、精氨酸分解、藻蛋白酸鹽生成、鼠 李糖脂生成、乙偶姻分解甘露糖攝取和肺氨酸亞氨基肽酶激活13。 因此，啟動子對于RpoN的甲基化存在至關(guān)重要的尤為重要影響。3. 2. 3、EBPsRpoN的轉(zhuǎn)錄需要某些特定激活蛋白(enhance binding proteins)的參與，他們發(fā)生改變轉(zhuǎn)錄起始復合物構(gòu)象來與轉(zhuǎn)錄復合 物通過作用。激活蛋白結(jié)合在UAS區(qū)，并在宿主因子幫助下讓在UAS 區(qū)與啟動子之間插入一個回折。激活蛋白上。54-RXAP重

19、要一環(huán)酶結(jié) 構(gòu)域具有能水解ATP的腺甘酸七磷酸酶的活性14。增強蛋白屬于雙 組分調(diào)節(jié)，當細菌處于低濃度氮源前會，組氨酸激活酶NtrB促使NtrC 磷酸化，從而結(jié)合到UAS區(qū)激活轉(zhuǎn)錄；高濃度氮源時，磷酸化的NtrC 減少，非磷酸化的NtrC雖然會結(jié)合到UAS區(qū)，卻無法失活轉(zhuǎn)錄的功能。 在致病性鉤端螺旋體當中，通過對RpoN的激活蛋白FhlA的研究中發(fā) 現(xiàn)，fhlA缺失株中LA1188、LA1968、amtB三個氮代謝相關(guān)基因的表達 量均下調(diào)，推測其通過FhlA-RpoN信號通路從而影響轉(zhuǎn)錄。所以，激 活蛋白對RpoN的轉(zhuǎn)錄是必不可少的。4、結(jié)語與展望目前，在很多菌種中對RpoN甚至有一定的的研究

20、。RpoN缺失 細菌在一些有所不同的環(huán)境壓力下存活能力減弱，如酸堿性環(huán)境、高 滲環(huán)境、饑餓條件、氧化耐受條件下條件生還能力改變，表明RpoN是 重要的壓力調(diào)控因子同時還調(diào)控氮源以及碳源的，對鞭毛非常大以及 生物被膜的合成也存在一定的關(guān)聯(lián)，細菌對于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并不是 簡單的單一通路，細菌必須通過各種信號通路確?；虻谋磉_，以調(diào) 適不同的環(huán)境，其中RpoN就是典型的調(diào)控遺傳，RpoN作為一個。因 子，是細菌轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控技術(shù)水準網(wǎng)絡(luò)的一個重要組分，RpoN轉(zhuǎn)錄組 水平的研究，對于調(diào)控細菌的研究機制來說，具有積極意義。近幾年由于環(huán)境的破壞以及抗生素的濫用，使得在養(yǎng)殖業(yè)中 所更為對細菌的病害防治越來越

21、難。RpoN調(diào)控多種基因，由于Rpo的 缺失也能導致細菌致病能力的下降，因此RpoN的研究為細菌防治提供 新的策略。家族調(diào)控的基因數(shù)量是非常大的，其次不同家族成員的 多缺失情況下也會產(chǎn)生不同的結(jié)果。因子之間存在復雜的相互聯(lián)系, 相互之間的作用機制還有待我們深入研究。另外，維氏氣單胞菌廣泛分布于自然環(huán)境中，潰瘍動物感染 后癥狀多為急性腹瀉、菌血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎等，近年來，維氏 氣單胞菌毒力逐漸增強，因此越來越多的研究人員開始對其興趣。 RpoN在很多菌屬中是一系列毒力、壓力、運動上述的重要調(diào)控者。之 前關(guān)于維氏氣銅綠單胞菌中未曾有過關(guān)于RpoN的報道(資料可查)， 因此構(gòu)建其缺失株及其功能的

22、研究具有涵義重要意義。本實驗室一直 致力于維氏氣單胞菌的研究，實驗團隊積極構(gòu)建該基因的缺失株及互 補株，為維氏氣單胞菌RpoN功能研究奠定基礎(chǔ)，同時，也為豐富不同 菌株RpoN性質(zhì)提供數(shù)據(jù)的支持。參考文獻：1 Merrick M J. In a class of its own 一 the RNA polymerase sigma factor。；54 (oN) J. Molecular Microbiology, 2021, 10(5) :903.2李耘.固氮施氏假放線菌RpoN過氧化氫蛋白調(diào)控硝酸鹽 同化的促進作用機制D.中國農(nóng)業(yè)科學院，2021.3 Gui lion A, Brea D,

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