單克隆抗體制備操作方法及注意事項JEN

1、無菌室清潔要求 ：1、進入無菌間，須更換白大褂，口罩、鞋套必須戴上， 最好戴上帽子、手套；2、進去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不顯黑；柜內(nèi)垃圾當日及時清理； 柜內(nèi)所有實驗操作應在酒精燈前進行；經(jīng)常紫外殺菌；4、無菌間物件傳遞，經(jīng)窗口紫外照射方可；5、有關試劑使用后及時用封口膜封住；6、細胞培養(yǎng)蓋子旋松，以便二氧化碳氣體進入；拿瓶、加液體均需注意瓶口， 避免污染瓶蓋；7、出門后需要用鑰匙鎖上；8、整個無菌間兩周清潔一次； 免疫動物 ：選擇與瘤細胞同一品系的動物做為免疫對象， 現(xiàn)在常用的是 Balbc/c 小鼠， 6-8 周齡，一種抗原一次性注射 2-3 只小鼠，小

2、鼠不宜過大，雌性相對較 好； 首次注射抗原 100 微克與等體積弗氏完全佐劑混勻， 在背部兩側皮下與腹腔分別 注射，形成幾個小泡； 間隔兩周左右時間 （14 天）二次免疫注射抗原 50 微克與等體積弗氏不完全佐劑混勻，在背部皮下及腹腔分 別注射，通常上次背部小泡仍然存在；間隔兩周左右時間 （14 天） 三免小鼠注射抗原 50 微克與等體積弗氏不完全佐劑混勻，在背部皮下及腹腔分 別注射，通常上次背部小泡仍然存在；間隔 7-10 天左右時間 尾部采血測定抗體效價： 方法一：手拇指和食指從背部抓住小鼠頸部皮膚， 將小鼠頭朝下， 小鼠保定后將 其尾巴置于 50熱水中浸泡數(shù)分鐘，使尾部血管充盈。擦干尾部

3、，再用剪刀或 刀片剪去尾尖12mm用試管接流出的血液，同時自尾根部向尾尖按摩。取血 后用棉球壓迫止血并用 6%液體火棉膠涂在傷口處止血。每次采血量 0.1ml 。 方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同時抓住尾梢協(xié)助取血，另一 個人左手捏住小鼠尾巴根部， 右手用酒精棉球擦洗， 使尾部血管充盈， 食指抵住 尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液槍及時吸取全血2.5微升， 加在盛有97.5微升的PBS緩沖液中稀釋10倍，再稀釋一百倍，之后做倍比稀釋 測定效價，讀數(shù)到陰性血清值的 2.1 倍，合理效價應高于 12.8 萬倍。 實際操作顯示， 采血使用剪尾方法較好， 一人固定小鼠，

4、 另一人直接在尾端剪掉 1-2mm從尾根部向尾尖部按摩，在尾端可見一滴血，吸取 2.0微升加在2ml的 PBS容液中，直接稀釋1000倍，混勻，再倍比稀釋測定效價； 當日或次日， 對全血用生理鹽水進行倍比稀釋， 測定抗體效價， 效價未達到標準， 則繼續(xù)進行常規(guī)免疫， 效價達到標準， 則選擇效價最高的一只小鼠作為脾細胞源 鼠，并在細胞融合三天前尾靜脈注射加強免疫。隨后，取凍存好的瘤細胞進行復蘇、培養(yǎng)、擴瓶，直到單只小鼠細胞融合需要穩(wěn)定良好生長瘤細胞培養(yǎng)液約為 120ml （大約一周可以完成），之后可進行細胞融 合實驗；在細胞融合三天前 （72-96 小時），直接尾部靜脈注射 50 微克抗原加強免

5、疫； 先用燒杯固定小鼠露出尾巴，用溫水（水溫約 50 度左右）泡大約 2 分鐘，這樣 能使血管充分舒張。 用干棉球擦干； 用 1毫升注射器選擇兩側較淺的靜脈穿刺注 射抗原，位置選擇尾部中下 2/31/2 處比較好 ,從下向上扎，萬一一次扎不進，還 可以繼續(xù)使用此血管。 具體操作是左手食指和中指上下夾注你所選擇血管的靠近 身體的一邊 ,無名指和小指墊起一塊紗布或者紙巾 （建立一個穿刺的平面的作用 ）, 拇指壓住所選血管的尾尖端 ,上下夾住血管的距離應以不影響右手持針上下移動 為宜 .（否則容易人為建立穿刺的角度 ,而使右手持穿刺針穿刺過深 ,導致穿刺失敗 .） 右手持穿刺針 ,稍微挑起皮膚一點

6、,就可以平著進針 ,看到回血表明成功 ,還可以回 抽 ,見到回血后表明穿刺已進入血管 ,可以給藥 .穿刺結束后 ,用紗布壓住穿刺部位 反折尾部進行止血 .良好并徹底的止血對于血管可以起到很好的保護作用 ,這對于 需要天天穿刺給藥是非常有用的（一般小鼠需要按壓時間很長，否則易引起出 血）。如果尾部靜脈注射未能成功，則進行腹腔注射。瘤細胞飼養(yǎng)骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系， 這樣雜交融合率高， 也便于接種雜交 瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb常用骨髓瘤細胞系有：NS1 SP2 /0、X63 Ag8.653等。細胞的最大密度不得超106/ml, 般擴大培養(yǎng)以1 : 4 或6進行稀釋

7、傳代，每35天可傳代一次。上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或 輕微貼壁生長,只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。1 、顯微鏡觀察細胞形態(tài)，呈較亮表明細胞生長良好，反之顏色較深，可見一些 小黑點，可能細胞已大部分死亡；2、狀態(tài)良好，裝入二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 37C, 5%二氧化碳濃度，T25細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)液可加 15ml 含 10-20%的滅火小牛血清 DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng) （酒精擦洗，有菌及時擦洗，常規(guī)一月一次，常開）3、每日顯微鏡觀察細胞狀態(tài)，貼壁較多（細胞擠在一起幾乎無空白區(qū)域）或培養(yǎng)液顏色變黃換液 （倒出上清液， 加新鮮培養(yǎng)液大體蓋住底部， 細胞過多在 加新鮮培養(yǎng)基前吹打）一般 3-5

8、可重新長滿4、換液 2-3 次5、生長穩(wěn)定后，擴瓶，先 1:4（細胞液：新鮮培養(yǎng)基）擴瓶，之后可適當增大比例，擴增到自己需要的培養(yǎng)液；6、 凍存，取生長良好的細胞液，吹打混勻，轉到50ml 離心管中離心， 1000rpm10min 棄上清， 底部為白色沉淀，加新鮮凍存液（ DMEM 60 FBS30 DMSO 10 雙抗 1），分裝在 2ml 凍存管中加 1ml （約每 5ml 細胞液原液對 應1管一1ml）,在管子上面注明日期、名稱，先在4度中靜置數(shù)小時，再在 液氮液面上懸30一60min，之后放入液氮中凍存；7、復蘇，拉線取出凍存管， 用漂懸浮在盛有 37 度水的燒杯， 燒杯置于水浴鍋中，

9、待融化后轉移到含有新鮮培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中混勻， 進行培養(yǎng)，在次日一 定要更新培 養(yǎng)基， 去除DMSO，以有利于后續(xù)的培養(yǎng)；8、細胞融合時，將3瓶生長良好的細胞液轉移在 50ml 離心管中， 1000rpm 10min，棄上清；加 30ml DMEM 離心洗滌一次， 加 10ml 重懸混勻，血細胞計數(shù)板 計數(shù)備用；在實際培養(yǎng)中，大概三天后細胞基本可以長滿，四天開始出現(xiàn)細胞死亡情況， 五天后有半數(shù)細胞死亡，六天后大部分死亡。HAT培養(yǎng)液濃度選擇商品化HAT多為50X，先用不完全培養(yǎng)基溶解后（10ml 管），按比例加到完 全培養(yǎng)基中制成HAT培養(yǎng)基；HAT 般含量偏高，做梯度培養(yǎng)瘤細胞實驗選擇 合

10、適的HAT培養(yǎng)液濃度；用24孔板和SP2/0進行在各孔中加等體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞，待長成單層細胞后依照下表添加不同量 的HAT培養(yǎng)觀察死亡情況；21.51.00.750.50.252M.51.00.750.50.2521.51.00.750.50.2521.51.00.75；0.50.25選擇第一天死亡半數(shù)細胞；第二天死亡大部分細胞；第三天全部死亡的濃度； 在實際試驗中，不同梯度的 HAT均可導致瘤細胞的快速死亡，具體試驗可選用 2%，亦可選用1%；飼養(yǎng)細胞制備在細胞融合前，三天內(nèi)購買 Balb/c或KM小鼠2-3只（個體易較大），在細胞融 合當天制備飼養(yǎng)細胞；器材與試劑：解剖工具、5ml玻

11、璃注射器、96孔板、50ml離心管、血細胞計數(shù) 板、HAT培養(yǎng)液、75%的酒精、250ml燒杯；操作方法：1、將小鼠摘眼球或拉頸脫臼處死，浸泡在75%酉精中5min,隨即放入超凈臺內(nèi)， 小鼠腹部朝上；2、酒精棉球腹部擦拭消毒，用止血鉗將腹部皮膚拉開，完全露出腹膜；3、鑷子小心提起小鼠腹部皮膚，注射 5ml DMEM溶液，輕輕按摩腹部1-2分鐘；4、用注射器吸出腹腔內(nèi)液體，轉于50ml離心管中，1000rpm, 10min,棄上清液；5、用5ml HAT培養(yǎng)液重懸沉淀，細胞計數(shù)，補加液體至細胞濃度為2*105個/ml ； &加在96孔板中，每孔100微升，進行培養(yǎng)；（96孔板約為6塊）一般18-

12、24h后細胞生長良好；在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼 養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞 是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞。初始飼養(yǎng)細胞均為小圓形，之后逐漸曾梭形，即巨 噬細胞，可吞噬死亡細胞殘片，梭形細胞較多時，周圍會出現(xiàn)相對空白的區(qū) 域，反之，巨噬細胞較少，在換液時應適當補充飼養(yǎng)細胞；脾細胞懸液制備免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。1、解剖三天（ 72-96 小時）前尾

13、部靜脈注射（難以操作可腹腔注射） ，每只 50 微克抗原加強免疫；2、解剖工具滅菌， 單個牛皮紙包裹， 在金屬盒內(nèi)滅菌； 在小燒杯口裹上尼龍網(wǎng)， 用繩子扎緊，牛皮紙包好滅菌；玻璃注射器牛皮紙包裹滅菌；3、 摘眼球處死小鼠，采血分離血清待測；小鼠在 75%酒精中浸泡5min，轉到超凈臺內(nèi)；4、解剖小鼠小心取出脾臟，剪刀碰到小鼠體外或使用次數(shù)較多則更換剪刀，以減少污染，取出脾臟后轉移到盛有 5-10ml 的不完全培養(yǎng)基平皿中清洗，一 般更換兩個平皿，然后將脾臟轉移到固定在滅菌燒杯（ 50ml 即可）的尼龍 網(wǎng)上，用彎頭眼科剪盡量剪碎，用 5ml 玻璃注射器內(nèi)芯研磨脾臟；5、用不完全培養(yǎng)基緩慢沖洗，

14、直到將脾臟細胞完全沖下；6 將燒杯內(nèi)液體轉移到50ml離心管內(nèi)，1000rpm 10min,棄上清；7、不完全培 養(yǎng)基 離心洗滌一次（也可以不做） ；8、用不完全培養(yǎng)基重懸沉淀（重懸要輕柔） ，獲得脾細胞懸液；細胞計數(shù)，一般一只小鼠可得1.0-2.5X 108個脾細胞；細胞融合1）取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞 SP2/0，1000rpm離心10分鐘，棄上清，用不完 全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌 2次。2）同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌 2 次。3）將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 : 10的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用 不完全培養(yǎng)液洗1次，800rpm,

15、10分鐘。4）棄上清，用滴管 （移液槍 ）吸凈殘留液體，以免影響 PEG 的濃度。5） 輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動（可將離心管在手臂上輕磕）。6）在37E下融合，用盛滿水的大燒杯，預熱到 37C,在60秒內(nèi)延管壁緩慢加入預熱的1ml45% PEG（Merek,分子量1500）含5% DMSO，邊加邊轉動離心管；靜置作用 60 秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至 90 鐘；加預熱的不完全培養(yǎng)液，終止 PEG 作用，每隔 1 分鐘分別加入 1ml， 2ml， 3ml， 4ml， 5ml。7）離心， 800rpm， 6 分鐘。8）棄上清，用已經(jīng)配制好的 HAT 培養(yǎng)液取少量輕輕混懸融合細胞，切

16、記不能用 力吹打，以免使融合在一起的細胞散開，再混入培養(yǎng)液中；9）根據(jù)所用 96 孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液。10） 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的 96孔板，200卩/孔，37C、5%CO2 在中間適當時間，制備飼養(yǎng)細胞，離心、重懸，并混入到 HAT 培養(yǎng)液中，與融 合細胞一起鋪到 96孔板中；選擇性培養(yǎng)（篩選雜交瘤）一般選擇 HAT 選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)三天，進行換液，每孔取 100 微升加 100 微 升（這時可以考慮適當補充飼養(yǎng)細胞） ，觀察見梭形細胞較多或原細胞被吞噬較 多較好；在培養(yǎng)三天，孔內(nèi)相對空白較好，進行再次換液或直接進行效價檢測， 發(fā)現(xiàn)有陽性孔，則及時進行克隆化。檢測

17、一般取樣 100 微升，選擇效價在 2.0以上者，在觀察對應孔細胞是否存活， 存活則可克隆化，不存活可考慮放棄或在 24 孔板內(nèi)加飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)一段時間， 這時改用 HT 培養(yǎng)液；抗體的檢測篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中， 僅少數(shù)能分泌針對免 疫原的特異性抗體。 一般在雜交瘤細胞布滿孔底 110 面積時，即可開始檢測特 異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。常用的方法有：ELISA、RIA、FACS（熒光激活細胞分類儀）、IFA;雜交瘤的克隆化有限稀釋法的程序1）制備飼養(yǎng)細胞懸液 （同融合前準備 ）2）陽性孔細胞的計數(shù)，并調(diào)細胞數(shù)在 15X 103/ ml3）取130個細胞放入6

18、.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞/ ml, 100 卩l(xiāng)/孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼 養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)為10個/ml, 100卩l(xiāng)/孔加D、E、F三排，為每孔1 個細胞。余下 2.2ml 細胞懸液補加 2.2ml 含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù) 5 個/ml, 100卩l(xiāng)/孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。4）培養(yǎng) 4 5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆， 補加完全培養(yǎng)液 200卩l(xiāng)/孔。5）第 8 9 天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。 注：初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加 HT。 直接稀釋法：1

19、 、制備飼養(yǎng)細胞懸液；2、 陽性孔細胞計數(shù)，用不完全培養(yǎng)液進行倍比稀釋，可選用1.5ml 離心管，每 組1ml，將細胞濃度控制在100-1000/ml，吸取含100個細胞的培養(yǎng)液加在20毫 升混有飼養(yǎng)細胞的 HA 培養(yǎng)液中，均勻鋪在一塊 96 孔板中，理論值每孔含有一 個細胞；3、培養(yǎng)一周左右，進行效價測定；4、 每板選擇一孔效價較高的進行二次克隆化，這次可不加HT 和飼養(yǎng)細胞； 培養(yǎng)一周左右，再次進行效價測定；5、如此，直到所有測定孔均為陽性，選擇測定孔最好是單細胞群落，這最可能 是單個細胞長成的群落，即單抗菌株；6、重復測定全部顯示陽性，則進行擴大培養(yǎng)，用細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，生長穩(wěn)定后 可進行

20、細胞凍存，保留該雜交瘤細胞株；待用；進行后續(xù)攻瘤實驗；瘤細胞的凍存雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣， 原則上細胞應在每支 安瓿含 1X 106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在 24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到 0C,再降溫 時一般按每分鐘降溫23C,待降至-70C可放入液氮中?；蚣毎芙抵?0C后 放-70C超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存 細胞要定期復蘇， 檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性， 在液氮中細胞可保存數(shù) 年或更長時間。單抗制備簡要流程：免疫動物 四次 間隔兩周 達到一定效價加強免疫 三天后細胞融合96 孔板三天后換液 HAT 培養(yǎng)（可適當添加飼養(yǎng)細胞） 三天后換液三天后直到孔底細胞生長良好測定效價 選擇陽性孔克隆化 HT培養(yǎng)24孔板邙陽性孔取100微升加到0.5ml中混勻，取回100微升，少量計數(shù)，剩余部