玻璃器皿的清洗包扎、培養(yǎng)基的制備及滅菌

1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 玻璃器皿的清洗包扎，玻璃器皿的清洗包扎， 培養(yǎng)基的配制及滅菌培養(yǎng)基的配制及滅菌一、目的要求一、目的要求 o 1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培養(yǎng)皿的包扎方法；和培養(yǎng)皿的包扎方法；o 2、掌握培養(yǎng)基的制備原理和方法；、掌握培養(yǎng)基的制備原理和方法；o 3、掌握干燥滅菌、濕熱滅菌的原理和方法。、掌握干燥滅菌、濕熱滅菌的原理和方法。二、基本原理二、基本原理（一）實(shí)驗(yàn)室中使用的玻璃器皿簡介（一）實(shí)驗(yàn)室中使用的玻璃器皿簡介 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的玻璃器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的玻璃器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和用來培養(yǎng)微生物，因此

2、對(duì)其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。來培養(yǎng)微生物，因此對(duì)其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。玻璃器皿的質(zhì)量一般要求玻璃器皿的質(zhì)量一般要求硬質(zhì)玻璃硬質(zhì)玻璃，才能承受高溫和短暫灼燒而，才能承受高溫和短暫灼燒而不致破壞；玻璃器皿的不致破壞；玻璃器皿的游離堿含量要少游離堿含量要少，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的酸，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的酸堿度；對(duì)玻璃器皿的堿度；對(duì)玻璃器皿的性狀和包裝方法的要求性狀和包裝方法的要求，以能防止污染雜菌，以能防止污染雜菌為準(zhǔn)；為準(zhǔn)；洗滌洗滌玻璃器皿的方法不當(dāng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。目前微生玻璃器皿的方法不當(dāng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。目前微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，有些玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、吸管等）已被物學(xué)

3、實(shí)驗(yàn)室中，有些玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、吸管等）已被一次性一次性塑料制品塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的實(shí)驗(yàn)室用具。所代替，但玻璃器皿仍是重要的實(shí)驗(yàn)室用具。 o 清洗清洗o 包裝包裝o 滅菌滅菌洗滌劑、試管刷等洗滌劑、試管刷等報(bào)紙、牛皮紙、專用塑料袋或器皿等報(bào)紙、牛皮紙、專用塑料袋或器皿等干熱滅菌干熱滅菌 濕熱滅菌濕熱滅菌 紫外滅菌紫外滅菌 過濾過濾玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗器皿包扎器皿包扎二、基本原理二、基本原理（二）培養(yǎng)基簡介（二）培養(yǎng)基簡介 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基

4、質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。種微生物或積累代謝產(chǎn)物。 在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。 按成分：按成分： 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；按物理性質(zhì)：按物理性質(zhì)： 固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；按用途：按用途： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等?；A(chǔ)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等。 培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)基的成分和pH 不同種類的

5、培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子等。不同微生物對(duì)源、無機(jī)鹽和生長因子等。不同微生物對(duì)pH要求不一要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細(xì)一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌培養(yǎng)基的菌和放線菌培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的（嗜堿一般為中性或微堿性的（嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外）。所以配制培養(yǎng)基時(shí)，都要根據(jù)細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外）。所以配制培養(yǎng)基時(shí)，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調(diào)到合適的范圍。調(diào)到合適的范圍。 配制培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的原則是什的原則是什么？么？ 根據(jù)菌種與

6、用途而選擇和配制培養(yǎng)基。根據(jù)菌種與用途而選擇和配制培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基的配制見實(shí)驗(yàn)書附錄常用培養(yǎng)基的配制見實(shí)驗(yàn)書附錄 P241 o 實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有干熱滅菌法、高壓蒸汽滅菌法、實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法有干熱滅菌法、高壓蒸汽滅菌法、紫外線照射法和微孔濾膜法等。紫外線照射法和微孔濾膜法等。o 干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。o 紫外線殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的紫外線殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了鏈的交聯(lián)，從

7、而抑制了DNA的復(fù)制。的復(fù)制。o 過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。 （三）滅菌的常用方法和基本原理（三）滅菌的常用方法和基本原理 高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加

8、了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。 紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的，波長為紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的，波長為200300nm的紫外的紫外線都有殺菌能力，其中以線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長一定的條件下，的殺菌力最強(qiáng)。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)制主要是紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了的

9、形成，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使，再使O2氧化生成臭氧氧化生成臭氧（O3）或使水（）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（）氧化生成過氧化氫（H2O2），），O3和和H2O2均有均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室、接種箱、手術(shù)只適用于無菌室、接種箱、手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過。紫外線燈距照射物以不超過12m為為宜。宜。 此外，為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外線燈此外，為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外

10、線燈以前，可在無菌室內(nèi)（或接種箱內(nèi)）噴灑以前，可在無菌室內(nèi)（或接種箱內(nèi)）噴灑35的石的石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無菌室內(nèi)的桌面，凳另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌。無菌室內(nèi)的桌面，凳子可用子可用23的來蘇爾擦洗，然后再開紫外線燈照射，的來蘇爾擦洗，然后再開紫外線燈照射，即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。即可增強(qiáng)殺菌效果，達(dá)到滅菌目的。結(jié)合理論知識(shí)結(jié)合理論知識(shí)和生活，在使和生活，在使用紫外滅菌時(shí)用紫外滅菌時(shí)你應(yīng)該注意什你應(yīng)該注意什么？么？滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)操作中的重要意義滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)操作中的重要意義

11、 在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)純培養(yǎng)，不能有任何，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的行嚴(yán)格的消毒和滅菌消毒和滅菌。消毒與滅菌不僅是從事微生物學(xué)。消毒與滅菌不僅是從事微生物學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實(shí)用技術(shù)，和整個(gè)生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實(shí)用技術(shù)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、食品、生物制品等各方面而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、食品、生物制品等各方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 ？區(qū)別？區(qū)別？消毒消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，一般是指消滅病原菌

12、和有害微生物的營養(yǎng)體而言，滅菌滅菌則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，包括芽孢和孢子。則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，包括芽孢和孢子。三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材 o 溶液和試劑：牛肉膏、蛋白胨、溶液和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、可溶性淀粉、可溶性淀粉、KNOKNO3 3、K K2 2HPOHPO4 43H3H2 2O O、MgSOMgSO4 47H7H2 2O O、FeSOFeSO4 47H7H2 2O O、KHKH2 2POPO4 4、葡萄糖、孟加拉紅（、葡萄糖、孟加拉紅（1%1%的水溶液）、鏈霉素的水溶液）、鏈霉素（1%1%的水溶液）、的水溶液）、1mol/L NaOH1mol/L Na

13、OH、1mol/L HCl1mol/L HCl。o 儀器和其他用品：試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、玻璃儀器和其他用品：試管、三角燒瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pHpH試紙（試紙（pH5.5pH5.59.09.0）、棉花、牛皮紙（或鋁箔）、）、棉花、牛皮紙（或鋁箔）、記號(hào)筆、麻繩和紗布等。記號(hào)筆、麻繩和紗布等。四、操作步驟四、操作步驟 （以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例）（以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例） 實(shí)驗(yàn)教材實(shí)驗(yàn)教材P246第一件事？第一件事？計(jì)算計(jì)算蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 10g牛肉膏牛肉膏 3g乳糖乳糖 5gNa

14、Cl 5g1.6%溴甲酚紫溴甲酚紫 1 ml蒸餾水蒸餾水 1000 ml 6g1.8g3g3g0.6 ml200200 ml ml3 50ml 2支支 5ml 10支支1 5ml 4支支共共 3 3 150ml 150ml 1 1 40ml 40ml可先配制可先配制200ml 3200ml 3 ，分裝后，稀釋到，分裝后，稀釋到1 1，再進(jìn)行分裝。再進(jìn)行分裝。 四、操作步驟四、操作步驟 （以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例）（以配制乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基為例） 實(shí)驗(yàn)教材實(shí)驗(yàn)教材P2461 1、稱量：、稱量：2 2、熔化：、熔化： 3 3、按比例加、按比例加1.6%1.6%溴甲酚紫乙醇溶液溴甲酚紫乙醇溶

15、液 4 4、調(diào)、調(diào)pHpH： 5 5、分裝：、分裝： 6 6、加塞：、加塞： 7 7、包扎：、包扎： 8 8、滅菌：、滅菌： 9 9、無菌檢查：、無菌檢查： 按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、乳按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、乳糖、糖、NaCl放入燒杯中。（牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在放入燒杯中。（牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯。也可小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。）牛肉膏便會(huì)

16、與稱量紙分離，然后立即取出紙片。）在上述燒杯中先加入在上述燒杯中先加入少于少于所需要的水量，用玻璃棒攪所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，或在磁力攪拌勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，或在磁力攪拌器上加熱溶解。藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總器上加熱溶解。藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積；體積； 在未調(diào)在未調(diào)pH之前，先用精密之前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中滴加入如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其試紙測(cè)其pH，直至，直至pH達(dá)到達(dá)到7.2

17、7.4。反之，用。反之，用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)各值不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)，否則，將會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對(duì)于有些要求離子的濃度。對(duì)于有些要求pH值較精確的微生物，其值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說明書）。的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說明書）。 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入有小倒管（德漢按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入有小倒管（德漢氏小管）的試管內(nèi)氏小管）的試管內(nèi) 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包

18、一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期；用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期； 將上述培養(yǎng)基以將上述培養(yǎng)基以115，20min高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌。（操作演示）（操作演示） 將滅菌培養(yǎng)基放入將滅菌培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)的溫室中培養(yǎng)2448h，以，以檢查滅菌是否徹底。檢查滅菌是否徹底。 分裝分裝按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入 試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。 分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液體分裝高度以試管高度的液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，滅菌后制成斜面，如圖如圖-2。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜