QPCR技術(shù)細(xì)節(jié)

1、程濤程濤中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)節(jié)決定成敗QPCRQPCR的技術(shù)細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響的技術(shù)細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)與常規(guī) PCR技術(shù)比較：技術(shù)比較：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始

2、模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光定量熒光定量PCR原理原理 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線 熒光閾值熒光閾值 Ct值值熒光定量熒光定量PCR原理原理 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶的催化動(dòng)力學(xué)原理。擴(kuò)增過(guò)程遵循酶的催化動(dòng)力學(xué)原理。 反應(yīng)初期反應(yīng)初期，目的，目的DNA片段呈片段呈指數(shù)擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的。隨著目的DNA產(chǎn)產(chǎn)物逐漸積累，在引物一模板與物逐漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入片段的增加減慢進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)停滯效應(yīng)”，

3、又稱，又稱“平臺(tái)期平臺(tái)期”。到。到達(dá)平臺(tái)期所需達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率、擴(kuò)增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。到達(dá)平臺(tái)期前，競(jìng)爭(zhēng)等因素。到達(dá)平臺(tái)期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行聚合酶一般要進(jìn)行25次次以上以上PCR循環(huán)。循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺(tái)期在多數(shù)情況下，平臺(tái)期在PCR反應(yīng)中不可避免。反應(yīng)中不可避免。 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律產(chǎn)物的積累規(guī)律 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖熒光定量熒光定量PCR定量原理定量原理擴(kuò)增曲線熒光定量熒光定量PCR定量原

4、理定量原理為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確呢？為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確呢？熒光定量熒光定量PCR定量原理定量原理 盡管終點(diǎn)產(chǎn)物的量不恒定，但人們發(fā)現(xiàn)盡管終點(diǎn)產(chǎn)物的量不恒定，但人們發(fā)現(xiàn)CtCt（cycle thresholdcycle threshold）與模板起始濃度有密切聯(lián)系。與模板起始濃度有密切聯(lián)系。Ct值的定義：值的定義： PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)CycleCycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）RnRn（熒光強(qiáng)度）（熒光強(qiáng)度）Ct value 熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值值1 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline）1 熒光閾值的缺省設(shè)置是

5、315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍1 手動(dòng)設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段1 真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)閾值熒光定量熒光定量PCR原理原理熒光閾值熒光閾值定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理Cycle numberCycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration1 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。1 Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)線性關(guān)系、擴(kuò)增效

6、率確認(rèn)檢測(cè)靈敏度確認(rèn)檢測(cè)靈敏度確認(rèn)No Template Control(NTC)No Template Control(NTC)確認(rèn)確認(rèn)PCRPCR擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E E）:0.9-1.1:0.9-1.135Cycles35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用如果采用SYBRSYBR檢測(cè)方法，檢測(cè)方法，30Cycles30Cycles內(nèi)無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增內(nèi)無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35 Cycles35 Cycles內(nèi)無(wú)引物二聚體產(chǎn)生內(nèi)無(wú)引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（r r2 2）：大于）：大于0.980.98熒光定量熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)反應(yīng)性的確認(rèn)內(nèi)容概要內(nèi)容

7、概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法非特異性熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I特異性熒光標(biāo)記特異性熒光標(biāo)記 TaqMan Probe常用熒光標(biāo)記方法常用熒光標(biāo)記方法SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法作用機(jī)理作用機(jī)理問(wèn)題點(diǎn)：?jiǎn)栴}點(diǎn)： SYBR Green

8、ISYBR Green I與雙鏈與雙鏈DNADNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增非特異性擴(kuò)增或或引物二聚體引物二聚體的產(chǎn)生，的產(chǎn)生，也將也將 同時(shí)被檢測(cè)到，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。同時(shí)被檢測(cè)到，從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法問(wèn)題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)問(wèn)題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：關(guān)鍵點(diǎn)： 設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！原始圖譜原始圖譜對(duì)數(shù)圖譜對(duì)數(shù)圖譜SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線融解曲線融解曲線分析，單一融解曲線分析，單

9、一峰無(wú)非特異性熒光峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)性熒光，因此定量不準(zhǔn)確確SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線融解曲線% 對(duì)對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性模板沒(méi)有選擇性% 使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針使用方便，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針% 具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)% 容易產(chǎn)生假陽(yáng)性容易產(chǎn)生假陽(yáng)性 % 對(duì)引物特異性要求較高對(duì)引物特異性要求較高% 不能進(jìn)行多重定量不能進(jìn)行多重定量缺缺 點(diǎn)點(diǎn)SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)TaqmanTaq

10、man探針?lè)ㄌ结樂(lè)ㄔ碓?5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) 探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分開(kāi)，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針TaqmanTaqman探針?lè)ㄌ结樂(lè)üぷ鳈C(jī)理工作機(jī)理1 1、引物、探針的設(shè)計(jì)：、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為59-60 2 2、反應(yīng)參數(shù)的確定：、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶5

11、3外切核酸酶活性在60 最高），也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度 3 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小CtCt值，最大信號(hào)值，最大信號(hào)/ /背景比值背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4 4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)PCRPCR相同相同TaqmanTaqman探針?lè)ㄌ结樂(lè)≒CRPCR體系的建立體系的建立TaqmanTaqman探針?lè)ㄌ结樂(lè)晒鈽?biāo)記物的選擇熒光標(biāo)記物的選擇% 高度特異性高度特異性% 重復(fù)性好重復(fù)性好% 可進(jìn)行多重定量可進(jìn)行多重定量?jī)?yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)% 只適合一個(gè)特定的目標(biāo)只適合一個(gè)特定的目標(biāo)% 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高委托公司標(biāo)記，價(jià)格較

12、高% 不易找到本底低的探針不易找到本底低的探針缺缺 點(diǎn)點(diǎn)TaqmanTaqman探針?lè)ㄌ结樂(lè)▋?yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)不同定量方法的比較不同定量方法的比較方法方法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍適用范圍SYBR Green I SYBR Green I 方法方法適用性廣適用性廣靈敏靈敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現(xiàn)非特異性易出現(xiàn)非特異性帶帶不能進(jìn)行多重定不能進(jìn)行多重定量量適合科研中對(duì)各種目的適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究組動(dòng)植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特異性高特異性高重復(fù)性好重復(fù)性好多重定量多重定量?jī)r(jià)格

13、高價(jià)格高只適合特定目標(biāo)只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究基因研究, ,藥物療效考藥物療效考核核遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定濃度確定技能要求技能要求環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析儀器軟件儀器軟件RTRT上機(jī)上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇分析方法分析方法樣品制備樣品制備環(huán)境要求環(huán)境要求模

14、板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RTRT上機(jī)上機(jī)濃度確定濃度確定無(wú)RNase環(huán)境使用無(wú)RNase耗材專用RNase-free工具分光光度計(jì)檢測(cè)電泳檢測(cè)RTRT反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機(jī)上機(jī)AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)濃度確定濃度確定環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制RTRT樣品制備樣品制備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機(jī)上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評(píng)價(jià)引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（3次）設(shè)置空白和陰性對(duì)照GC：5060Tm：5560單個(gè)堿基重

15、復(fù)4個(gè)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長(zhǎng)度：50150bp引物位置反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化RTRT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積5ul，推薦2050ulMg2調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量?jī)?yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時(shí)間：產(chǎn)物長(zhǎng)度決定擴(kuò)增效率：90110重復(fù)性：std0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R0.99或R2 0.98標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)樣本陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照技能要求技能要求誤差控制誤差控制上機(jī)上機(jī)試劑選擇試劑選擇RTRT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析自配DBI Real mastermixRoche-Lightcycler seriesROTOGE

16、N-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制45oC55oC65oC溶解曲線溶解曲線擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, reade

17、very 0.2oC, hold 1 sec.同一cDNA樣品的三個(gè)重復(fù)如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們?cè)跀U(kuò)增曲線上的如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們?cè)跀U(kuò)增曲線上的CTCT值之差，應(yīng)該相等，但值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個(gè)濃度低的樣品是后邊幾個(gè)濃度低的樣品CTCT值明顯提前了，由熔解曲線可知對(duì)于濃度低的樣品，引值明顯提前了，由熔解曲線可知對(duì)于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。1. 1. 模板濃度越低，染料法的誤差越大模板濃度越低，染料法的誤差越大2. 2. 某一孔熒光信號(hào)特別強(qiáng)某一孔熒光信號(hào)特別強(qiáng)原因：原因： 試劑配制時(shí)反應(yīng)液沒(méi)完全溶化，導(dǎo)致探針量

18、在一管中增多；試劑配制時(shí)反應(yīng)液沒(méi)完全溶化，導(dǎo)致探針量在一管中增多； 試劑配制時(shí)沒(méi)有充分混勻致各管中各成分的量不同；試劑配制時(shí)沒(méi)有充分混勻致各管中各成分的量不同； 也可能是也可能是PCRPCR儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，這時(shí)就要清除熱槽中的污染；儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，這時(shí)就要清除熱槽中的污染；3.3.樣品濃度跨度過(guò)大樣品濃度跨度過(guò)大樣品濃度過(guò)高，至陽(yáng)性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，樣品濃度過(guò)高，至陽(yáng)性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，4. 部分樣本擴(kuò)增效率過(guò)低部分樣本擴(kuò)增效率過(guò)低原因：原因： 提取液殘留，一定程度抑制了提取液殘留，一定程度抑制了PCRPCR反應(yīng)；反應(yīng)； 反應(yīng)液未嚴(yán)格取量

19、混勻或分裝不反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不均勻；試劑失效；均勻；試劑失效；5.5. 陰性對(duì)照或空白對(duì)照翹尾陰性對(duì)照或空白對(duì)照翹尾原因：模板提取環(huán)境有污染；模板提取操作有污染；試劑配制過(guò)程存在污染；原因：模板提取環(huán)境有污染；模板提取操作有污染；試劑配制過(guò)程存在污染；6. 6. 直線型擴(kuò)增曲線直線型擴(kuò)增曲線原因：探針部分降解（探針降解原因：原因：探針部分降解（探針降解原因：a.a.探針?lè)磸?fù)凍融探針?lè)磸?fù)凍融稀釋的探針可在稀釋的探針可在44保存保存至少至少3 3個(gè)月，應(yīng)避免反復(fù)凍融；個(gè)月，應(yīng)避免反復(fù)凍融；b.b.探針在光線下暴露時(shí)間太長(zhǎng)）；反應(yīng)液中有探針在光線下暴露時(shí)間太長(zhǎng)）；反應(yīng)液中有PCRPCR抑制

20、抑制物；物；7. 7.山坡形曲線山坡形曲線原因：常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。原因：常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。8.8.擴(kuò)增曲線斷裂擴(kuò)增曲線斷裂原因：基線選取范圍不對(duì)，基線終點(diǎn)大于原因：基線選取范圍不對(duì)，基線終點(diǎn)大于CtCt值，這通常是由于模板值，這通常是由于模板DNADNA濃度過(guò)高所致，濃度過(guò)高所致，因因CtCt值值1515，而基線范圍仍取，而基線范圍仍取3 31515，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過(guò)，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過(guò)高，解決辦法：減少基線終點(diǎn)至高，解決辦法：減少基線終點(diǎn)至CtCt值前值前4 4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)

21、據(jù)9.9.基線下滑基線下滑原因：基線選取范圍不對(duì)，可試著將基線范圍改大一些，這一問(wèn)題常因試劑質(zhì)量所致；原因：基線選取范圍不對(duì)，可試著將基線范圍改大一些，這一問(wèn)題常因試劑質(zhì)量所致；10.10.沒(méi)有擴(kuò)增曲線沒(méi)有擴(kuò)增曲線原因：原因：PCRPCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號(hào)讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步，參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號(hào)讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步，即即stage 1stage 1階段；電腦設(shè)定了自動(dòng)休眠；階段；電腦設(shè)定了自動(dòng)休眠；11. 擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰原因原因： 反應(yīng)過(guò)程中電壓不穩(wěn)定；可能在反應(yīng)過(guò)程中電壓不穩(wěn)定；可能在2020循環(huán)左

22、右儀器有停下或者儀器有開(kāi)蓋，循環(huán)左右儀器有停下或者儀器有開(kāi)蓋，使得光線突然增強(qiáng)；使得光線突然增強(qiáng)； 如果尖峰向下，也可能是鹵素?zé)衾匣?，這時(shí)應(yīng)更換；如果尖峰向下，也可能是鹵素?zé)衾匣?，這時(shí)應(yīng)更換；數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)分析方法分析方法上機(jī)上機(jī)RT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備相對(duì)定量：2Ct法絕對(duì)定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng) 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法 絕對(duì)定量解析方法絕對(duì)定量解析方法Sample25絕對(duì)定量的定義絕對(duì)定量的定義

23、0 Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品 可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系0 根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆質(zhì)粒質(zhì)?；蚪M基因組DNADNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備拷貝數(shù)的計(jì)算：拷貝數(shù)的計(jì)算：待測(cè)樣本濃度（ng/ul）OD26040稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)324待測(cè)樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量61014倍比梯度稀釋方法倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩

24、沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計(jì)算q 方方 法：法：從組織中提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以SYBR法進(jìn)行熒光定量檢測(cè)q 試試 劑：劑：DBIDBI公司SYBR realtime PCR試劑q 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105 、104 、 103 ；2個(gè)重復(fù)；設(shè)陰性空白對(duì)照q 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：提取RNA并反轉(zhuǎn)錄； 設(shè)計(jì)特異引物； 熒光定量擴(kuò)增； 結(jié)果分析：獲取樣品中目的基因的精確copy數(shù)。絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct

25、2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD標(biāo)準(zhǔn)品510328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品510425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品510522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品510618.6318.9218.770.10未知樣品? ?20.5620.4520.50.05空白對(duì)照NoneNone實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E E）計(jì)算）計(jì)算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用利用Mean Ct Mean Ct 作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線y =

26、 -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算未知樣品拷貝數(shù)的計(jì)算將Ct值帶入線性方程：20.5= -3.1726 X + 37.52QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)例X=20.5-37.52-3.1726=5.36 相對(duì)定量解析方法相對(duì)定量解析方法相對(duì)定量的必要性相對(duì)定量的必要性管家基因篩選管家基因篩選P P P P P P O O 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 -Ct法法 兩種常用的分析方法兩種常用的分析方法 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲

27、線對(duì)對(duì)照樣品、待測(cè)樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計(jì)算公式求得相對(duì)值即為相對(duì)表達(dá)量。為相對(duì)表達(dá)量。 相對(duì)值相對(duì)值= =校正值校正值= =目的基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測(cè)樣品的校正值待測(cè)樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值對(duì)照樣品的校正值雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：公式：優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與

28、公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)樣品檢測(cè)樣品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)果校正值校正值相對(duì)量相對(duì)量對(duì)照樣品對(duì)照樣品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待測(cè)樣品待測(cè)樣品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待測(cè)樣品待測(cè)樣品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)公式：公式：F =F = 2 22 2 - -CtCt法法優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需作標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為 100 %100 %； 假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致； 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對(duì)定量方法之一 待測(cè)組目的基因平均Ct值待測(cè)組管家基因平均Ct值對(duì)照組目的基因平均Ct值對(duì)照組管家基因平均Ct值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Sample 處理前 處理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.4