菌種保存大家談甘油的濃度

1、菌種保存大家談。甘油的濃度。2009-08-15 01:13大家好！我是保藏中心，最近發(fā)現(xiàn)基因酷保藏中心的共享菌株的保存出現(xiàn)了較嚴(yán)重的問題，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心卻不能應(yīng)助，對此我們很抱歉！因此，在此向大家賜教，菌株應(yīng)如何保存呢？望大家能分享經(jīng)驗，多提出建議（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株為佳），一起努力搭建好這個平臺，讓它能幫到更多酷友！作者：保藏中心 時間：09-2-19 10:55有人說，冷凍干燥保藏法是菌種保藏最有效的方法之一。因為沒有做過，所以請教做過這方面的酷友，大腸桿菌的冷凍保藏應(yīng)該注意的事項？甘油冷凍保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？

2、作者：我是好人 時間：09-2-19 21:34冷凍干燥法是國內(nèi)外一致認(rèn)為比較理想的菌種保藏方法。冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液 或抱子懸液于安甑管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水開 華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成 無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常 用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達(dá)5 15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。

3、除 不產(chǎn)抱子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線菌、 酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。保藏菌種需用時，可在無菌環(huán)境下開啟安甑管，將無菌的培養(yǎng)基注入安甑管中，固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然 后將其接種于適宜該菌種生長的斜面上適溫培養(yǎng)即可。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備。不適合酷友頻繁的求 助菌種。我們實驗室保藏菌種，不管是細(xì)菌，放線菌還是霉菌和酵母，我們都是 用的甘油管保藏。就是劃斜面得到單菌落，將單菌落置于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù) 期，在EP管中保存，菌液與甘油體積比為1:1,甘油要滅菌的。-20攝氏度保 存即可。我們的菌種有保存七八年的依然能用。方

4、便快捷。管理員不妨試試。作者：保藏中心 時間：09-2-20 23:03:終于有酷友理我了！感動ing十分感謝您的指教！為了表達(dá)謝意，加兩點威望作者：保藏中心 時間：09-2-20 23:33如您所說，冷凍干燥法該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備， 不適合酷友頻繁的求助菌種。但考慮到一個菌株的傳代問題，菌種傳代次數(shù)對菌 株特性的影響？我有這樣的想法：每個菌種用冷凍干燥法保藏一些，也用甘油菌 保藏（用于給酷友應(yīng)助，一兩年后再拿冷凍干燥法保藏的菌種活化， 保新一批甘 油菌、穿刺菌用于應(yīng)助（其實保藏中心一直都有保甘油菌，但 06、07年的菌株 還是有出現(xiàn)問題）。這樣考慮怎樣呢？看了您

5、介紹的冷凍真空干燥保藏法的操作，有不明白的地方：1、保護劑如脫脂牛奶、淀粉、葡聚糖要如何處理滅菌呢？2、菌種在冷凍干燥機里冷凍干燥時會不會染菌，還是需要事先處理下冷凍干燥機？3、如何在真空條件下融封？因為沒有做過這方面的工作，很多不懂的，問了不少，請諒解。還有，液氮冷凍保藏法和冷凍干燥法相比哪種方法較好，那種比較適合保藏中心？還是有其它 方法更適合呢？大家多多提出寶貴意見、分享下經(jīng)驗啦！作者：我是好人 時間：09-2-22 20:295#保藏中心作者：我是好人 時間：09-2-22 20:43液氮超低溫保藏法是目前比較理想的一種菌種保藏方法， 已被國外一些菌種保藏 機構(gòu)作為常規(guī)的方法應(yīng)用，美國

6、的ATCC已于1965年開始用用，我國的菌種保 藏中心也正積極的創(chuàng)造條件，準(zhǔn)備或已采用此法。但投資費用較大，并要有個可 靠的氮源。作者：保藏中心 時間：09-2-24 09:50您好！您上傳的資料中介紹了好多種菌種保藏的方法，很受用，十分感謝您的幫助和支持！但我有一些疑問想請教下：1/您上傳的PPT中講到“在作低溫保藏時，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時胞內(nèi)冰晶較小，對細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。，按這樣說快速降溫對細(xì)胞

7、的損傷較小，但這與細(xì)胞放入液氮罐 前應(yīng)先進行梯度降溫的做法似乎有矛盾。2/甘油菌甘油終濃度為40% ,這個濃度是如何定的呢？因為甘油具有脫水作用，濃度高了會使菌株脫水死亡，有的人建議用終濃度為10%20%的濃度，您是如何看待這個情況呢？作者：我是好人 時間：09-2-27 10:27管理員您好，很佩服您發(fā)現(xiàn)問題的能力，嘿嘿，我這些資料都是在網(wǎng)上給您找的，我們實驗室也沒有這種設(shè)備，我也沒做過，所以很多問題也不是很清楚。我們保存菌種都是用的甘油保存，但也沒有注意到您說的甘油具有脫水這個問題， 很是 受用，以后我會注意的。我們用甘油保存過細(xì)菌，酵母，霉菌和放線菌，40%-50% 的甘油是它的最終濃度

8、。甘油濃度過低低溫保存易結(jié)冰，使菌死亡。我同學(xué)有直 接將菌液-20保存的，不加任何保護劑，但保存的時間很短，他們保存過一年的,但很多有死掉的。我們做大腸桿菌感受態(tài)，最終甘油是15%的濃度，有時結(jié)冰也會使菌死掉。我用40%-50%的甘油最終濃度一直很好，也不結(jié)冰，所以也沒 考慮您提出的那個問題，嘿嘿。對于液氮超低溫保藏我又查了本資料，它是把熔封的安甑管進行慢速冷凍，以每 份鐘下降1度的速度直至-35度，最后移到液氮中保藏。其他的就沒說什么了。很不好意思啊。作者：保藏中心 時間：09-2-28 17:18不用不好意思！大家互相交流學(xué)習(xí)。我也是上網(wǎng)查了相關(guān)的資料，發(fā)現(xiàn)有些細(xì)節(jié)問題說法不一，自己經(jīng)驗少

9、，所以不懂的問題要向大家請教！作者：wyat1984 時間：09-3-5 02:40我們實驗室都是用新鮮菌液+50%滅菌甘油1: 1混勻，終濃度25%甘油，-80度保存的。菌體可以多離心收集一點。凍干保存用的脫脂牛奶110度15分鐘滅菌。其實很多時候大家要的是質(zhì)粒而不是菌，一般的 DH5,JM109之類的大家都有。為什么不抽成質(zhì)粒保存呢？ -80度基本不會降解。作者：保藏中心 時間：09-3-5 10:13 您好！感謝您的支持。“其實很多時候大家要的是質(zhì)粒而不是菌，一般的DH5,JM109之類的大家都有。為什么不抽成質(zhì)粒保存呢？ -80度基本不會降解?！北２刂行牡馁|(zhì)粒都是抽 提保存的，我想您有

10、些誤解了，現(xiàn)出現(xiàn)的是菌株的保藏問題而不是質(zhì)粒的保藏問 題，DH5JM109之類的菌株是很多人都有，但也還有其它不少的菌株較少的。作者:nfu03200 時間：09-3-15 10:45我這里一般是需要用到質(zhì)粒的大腸桿菌用15%的甘油1:1和菌液混合，酵母用的是30%的甘油和菌液1: 1混合，然后放在-80度冰箱中保存，效果很好作者：保藏中心 時間：09-3-16 18:43我這里一般是需要用到質(zhì)粒的大腸桿菌用15%的甘油1:1和菌液混合，酵母用的是30%的甘油和菌液1: 1混合，然后放在-80度冰箱中保存，效果很好nfu03200 發(fā)表于 09-3-15 10:45質(zhì)粒的大腸桿菌用15%的甘油

11、1:1和菌液混合，甘油的終濃度7.5%,感覺挺低的，請問您那里-80度保存大概能保存多長時間？作者：ferraricyn 時間：09-3-20 15:17本帖最后由ferraricyn 于09-3-20 15:21 編輯個人覺得脫脂牛奶凍干的方法保藏效果較好，我們的霉菌就是這么弄哦，看了一下，原來都是細(xì)菌保藏，那還是加甘油保護，液氮速凍，-70保藏吧，呵呵另外，有的凍干機是有封口功能的，凍干機也是在無菌室內(nèi)操作的，凍干后可以取出封口，同樣是無菌條件下操作的作者：yueyuetby 時間：09-3-21 17:37我們實驗室的保存方式是，按 3: 1的比例加入菌液和甘油，一定要混勻，然后放在-7

12、0度冰箱中保存。作者：rcm001 時間：09-3-29 21:20本帖最后由rcm001 于09-3-29 21:23 編輯您好！您上傳的資料中介紹了好多種菌種保藏的方法，很受用，十分感謝您的幫助和支持！但我有一些疑問想請教下：1/您上傳的PPT中講到“在作低溫保藏時，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而保藏中心發(fā)表于09-2-24 09:50不是??！細(xì)菌保存最好要快速冷凍，我在PASTEUR作博士后時他們的PROTOCOL都是用液氮先澆在有菌液+冷凍液的 EP管上，凍好后放80度冰箱，可以保存10年左右。冷凍液配方需再找找再給你，印象中不是簡單的甘油 溶液動物細(xì)胞當(dāng)然是

13、要緩慢冷凍了。作者：rcm001 時間：09-3-29 21:43本帖最后由rcm001 于09-3-29 21:52 編輯如您所說，冷凍干燥法該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備， 不適合酷友頻繁的求助菌種。但考慮到一個菌株的傳代問題，菌種傳代次數(shù)對菌 株特性的影響？我有這樣的想法：每個菌種用冷凍干燥法保藏一些 保藏中心發(fā)表于 09-2-20 23:33凍干保護劑是先配成溶液，再用0.22um的濾膜過濾除菌，再按比例加到培養(yǎng)到 對數(shù)生長期的菌液；真正的凍干機操作當(dāng)然不會染菌了， 進去的空氣都是經(jīng)過濾 的；真空封融菌種管是把凍好的菌種管口套在抽氣機上，抽至一定真空度，如 6pa

14、,在噴燈上封融。凍干曲線（溫度和真空度隨時間調(diào)整的曲線）也影響到存 活率。作者：保藏中心 時間：09-3-30 10:35不是?。〖?xì)菌保存最好要快速冷凍，我在 PASTEUR作博士后時他們的 PROTOCOL都是用液氮先澆在有菌液+冷凍液的 EP管上，凍好后放80度冰 箱，可以保存10年左右。冷凍液配方需再找找再給你，印象中不是簡單的甘油 溶液。rcm001 發(fā)表于 09-3-29 21:20非常感謝！期待作者：rcm001 時間：09-3-30 21:59冷凍液配方來了：翻了半天，終于找到了，是HOGNESS ,哈哈excellentfor E.coli preservation10X Ho

15、gness Modified Freezing Medium:Solution A: 5 mM MgSO4x4 H2O, 20 mM Sodium Citrate,85 mM (NH4)2SO4, 45 % Glycerin.Solution B: 0,66 M KH2PO4, 1,3 M K2HPO4Dilute "B" 4X with "A" = 10 x HMFM (e.g., 1B + 4A)例子：10 x HMFM (Hogness Modified Freezing Medium)(For freezing of bacteria)Solut

16、ion AMgSO4.7 H2O 0.9 gNa3-citrate.2H2O 4.5 g(NH4)2 SO4 9 gGlycerol (100%) 440 gThe volume was adjusted to 800 ml with sterile water and sterilized by autoclaving.Solution BKH2PO4 18gK2HPO4 47gThe volume was adjusted to 200 ml with sterile water and sterilized by autoclaving.Before using, 640 ml solu

17、tion A was added to 160 ml solution B.作者：保藏中心 時間：09-3-31 10:32冷凍液配方來了：翻了半天，終于找到了，是HOGNESS ,哈哈excellent for E.coli preservation10X Hogness Modified Freezing Medium:Solution A: 5 mM MgSO4x4 H2O, 20 mM Sodium Citrate,85 mM (N .rcm001 發(fā)表于 09-3-30 21:59對于您的分享，代表需要它的人感謝您！需要的酷友大家來試試?yán)玻”２刂行臅L試看是否適合我們 為表示感謝，給

18、您加上兩點威望。作者：保藏中心 時間：09-3-31 10:47 冷凍液配方來了：-翻了半天，終于找到了，是HOGNESS ,哈哈excellentfor E.coli preservation10X Hogness Modified Freezing Medium:Solution A: 5 mM MgSO4x4 H2O, 20 mM Sodium Citrate,85 mM （N .rcm001 發(fā)表于 09-3-30 21:59Glycerol是保護劑，Na3-citrate 應(yīng)該是起到一個緩沖體系的作用吧？KH2PO4、K2HPO4這兩個是不是也是屬于緩沖體系的？其它的成分就猜不出了可

19、是在這些成分里沒有看到有營養(yǎng)成分，看過一些資料，他們的是有加血清、牛奶、培養(yǎng)基之類任一個成分的，沒營養(yǎng)成分的話，可以保存十年左右么？您能不能給我們稍微介紹下這個配方的基本原理呢？作者：rcm001 時間：09-4-3 13:01可是在這些成分里沒有看到有營養(yǎng)成分，看過一些資料 ，他們的是有加血清、牛奶、培養(yǎng)基之類任一個成分的，沒營養(yǎng)成分的話，可以保存十年左右么？1）GOOD QUESTION,你能指望大腸桿菌在80C條件下利用營養(yǎng)物質(zhì)嗎？那些蛋白之類的是保護劑。我用過他們保存10年的菌。2）所附文件應(yīng)該可以解釋為什么，還有酵母保存的使用方法。作者：保藏中心 時間：09-4-6 23:04可是在

20、這些成分里沒有看到有營養(yǎng)成分，看過一些資料，他們的是有加 血清、牛奶、培養(yǎng)基之類任一個成分的，沒營養(yǎng)成分的話，可以保存十年左右么？1）GOOD QUESTION,你能指望大腸桿菌在80C條件下利rcm001 發(fā)表于 09-4-3 13:01感謝您的指教！作者：rcm001 時間：09-4-7 15:37不用謝，應(yīng)該做的。順便提一下，取用菌種時也應(yīng)該特別小心，那些鬼子在我取菌種時都在邊上盯著， 不是怕我拿了菌種，是提醒我不要把菌種管化了再取，而是用滅菌牙簽挑取一點 冰凍物，放到試管中即可，菌種管應(yīng)飛速放回，盡量保持其溫度不變，覺得與其 長時間保存有關(guān)，特再告知。作者：保藏中心 時間：09-4-7 16:4525# rcm001作者:wwchhappy 時間：09-4-12 21:53液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，加入20 %的甘油，然后利用液氮速凍后，放置于超低溫冰箱（70度），可以長期保存。作者:ouclhf 時間:09-4-13 10:32菌株加了甘油放在負(fù)八十的冰箱里面，一般 3-5年都不會死的為什么會死呢，主要原因是溫度不夠低，如果是負(fù)二十或者負(fù)四十那么可能半年 就會死掉的。死了的菌接種液體LB培養(yǎng)基一般是活不了了，建議直接取1