乳制品中三聚氰胺的含量的測定(高效液相色譜法)實驗報告(共14頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上2009級化學教育儀器化學綜合性與設計性實驗指導老師：曹* 2011年 5月 30號 一、實驗目的1通過分析化學綜合性實驗、設計性實驗，培養(yǎng)學生初步的解決分析化學實際問題的能力，培養(yǎng)學生的創(chuàng)新意識與創(chuàng)新能力。2學習查閱參考文獻、綜合參考資料、設計小型分析化學實驗。3復習和鞏固有關理論基礎知識并用于指導實踐。4進一步熟練掌握實驗操作技術。 實驗題目：乳制品中三聚氰胺的含量的測定（高效液相色譜法） 摘要、關鍵詞：摘要 為建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色譜測定方法, 通過超聲提取, 離子交換萃取小柱凈化, 結合高效液相色譜進行樣品測定。 色譜條件: A液：0.9508

2、g 辛烷磺酸鈉（5 mmol/L）+ 1.0640 g檸檬酸（pH=3-4）用高純水品配制1L溶液；B液：甲醇；色譜條件：30%B+70%A。 色譜柱：CNWSIL C18液相色譜柱 （4.6×250mm，5 µm），檢測波長：239 nm結果表明: 三聚氰胺標準曲線為y = x +18978.83 , 相關系數(shù)R = 0., 在0.17110.0 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好, 方法檢出限為0.12 mg/L, 兩個樣品三個水平的加標回收率分別為96.34 % (RSD = 4.76)、84.86 % (RSD = 7.21) 、104.29 % (RSD = 7.63)

3、和95.31 % (RSD = 4.39) 、89.25 % (RSD = 3.88) 、92.59 % (RSD = 5.27)。關鍵詞 高效液相色譜; 三聚氰胺; 乳制品 引言一、目前有關三聚氰胺在乳制品中的概述：三聚氰胺(melamine) ）（化學式：C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料, 通常用于塑料制品中合成樹脂的生產(chǎn) 1 。它是白色，幾乎無味，微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶於、醚類、對身體有害，不可用於食品加工或食品添加物。 由于中國采用估測食

4、品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人摻雜進食品或飼料中，以提升食品或飼料檢測中的蛋白質(zhì)含量指標，因此三聚氰胺也被作假的人稱為“蛋白精”。 蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成。蛋白質(zhì)平均含氮量為16左右，而三聚氰胺的含氮量為66左右。常用的蛋白質(zhì)測試方法“”是通過測出含氮量乘以6.25來估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試含量虛高，從而使劣質(zhì)食品和飼料在檢驗機構只做粗蛋白質(zhì)簡易測試時蒙混過關。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使測試蛋白質(zhì)含量增加一個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白原料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結晶，沒有什么氣味和味道，所以摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。 奶粉事

5、件：近年來, 一些不法廠商將三聚氰胺添加到奶粉中, 以增加蛋白質(zhì)含量。 2008年9月, 震驚中外的“三鹿嬰幼兒奶粉事件” 2 暴露出乳制品行業(yè)的“潛規(guī)則”, 國內(nèi)一些知名乳品品牌也被檢出其產(chǎn)品中含三聚氰胺 3 。 各個品牌奶粉中蛋白質(zhì)含量為15-20%（晚上在超市看到包裝上還有標示為10-20%的），蛋白質(zhì)中含氮量平均為16%。某合格奶粉蛋白質(zhì)含量為18%計算，含氮量為2.88%。而三聚氰胺含氮量為66.6%，是鮮牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理論上就能提高0.625%蛋白質(zhì)。 微溶系指1g(ml)溶質(zhì)能在100ml1000ml中溶解，三聚氰胺在水中微

6、溶，在牛奶這種水包油型的乳液中溶解度未找到實驗數(shù)據(jù)，應該比水的溶解度要好一些，待驗證。 檢測方案：在現(xiàn)有奶粉檢測的國家標準中，主要進行蛋白質(zhì)、脂肪、細菌等檢測。三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，所以現(xiàn)有標準不會包含相應內(nèi)容。亦即三聚氰胺檢測目前并無國家標準。因此，德國萊茵TÜV集團參照美國食品化學品法典(FCC)HPLC-UV定量方法，同時還可采用HPLC/MS檢測方法（實驗室方法）對嬰兒食品，寵物食品，飼料及其原料(包括淀粉，大米蛋白, 玉米蛋白, 谷朊粉、糧油等)開展的檢測業(yè)務，檢測結果具備權威性。 因此, 如何快速、準確分析乳制品中的三聚氰胺成為多方關注的問

7、題. 本次設計性實驗在NY/T 13722007標準 4 的基礎上進行改進, 結合其他產(chǎn)品中三聚氰胺的測定方法 5 , 利用高效液相色譜法對乳制品進行三聚氰胺含量的測定。2、 對三聚氰胺的測定方法概述：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局與標準化管理委員會聯(lián)合發(fā)布了原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法，即國標GB/T22388-2008。這一新標準制定了高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法三種檢測方法與標準。三聚氰胺的檢測方法還包括試劑盒檢測法（ELISA）、離子交換色譜-紫外檢測法等。1、 高效液相色譜法（HPLC)：試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液離心后經(jīng)混合型陽離子交換

8、固相萃取柱凈化，洗脫物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色譜儀進行測定。在添加濃度2mg/kg10mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對標準偏差小于10%。2、 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS和GC-MS/MS）：試樣經(jīng)超聲提取、固相萃取凈化后，進行硅烷化衍生，衍生產(chǎn)物采用選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式（SIM）或多反應監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式（MRM），用化合物的保留時間和質(zhì)譜碎片的豐度比定性，外標法定量。其中GC-MS法在添加濃度0.05mg/kg2mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在70%110%之間，相對標準偏差小于10%；GC-MS/MS法在添加濃度0.005mg/kg1mg/kg濃度范

9、圍內(nèi)，回收率在90%105%之間，相對標準偏差小于10%。3、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）：試樣用三氯乙酸溶液提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證，外標法定量。在添加濃度0.01mg/kg0.5mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對標準偏差小于10%。4、 試劑盒檢測法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA）：試劑盒檢測法即為酶聯(lián)免疫吸附劑測定，是利用萃取液通過均質(zhì)及震蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定的一種方法。5、 離子交換色譜-紫外檢測法：何強建立離子交換色譜-紫外檢測法測定乳

10、制品中三聚氰胺。樣品用水和乙腈提取，分析時用LC-SCX離子交換色譜柱分離，濃度為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH3.0）-乙腈（70：30）為流動相，在紫外波長240nm處檢測。三聚氰胺為0.5mg/L-100.0mg/L時，質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系（r=0.9999），最低檢出限為1.0mg/kg，加標回收率為93.8%102.5%，RSD<3.5%。6、 其他檢測法：利用抗原與抗體相互識別的原理，制作出能識別三聚氰胺的抗體試紙，將試紙插入稀釋的奶制品中，則可檢測出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分離技術萃取樣品溶液，然后采用紫外可見光度法或化學檢驗的方法檢測樣品中三聚

11、氰胺的含量。三、選定實驗方案的原理：試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，（其中包括 試樣經(jīng)溶解、超聲提取、沉淀蛋白、過濾得到測試液），再經(jīng)高效液相色譜測定，根據(jù)保留時間和紫外吸收光譜定性，根據(jù)峰面積進行定量。三聚氰胺呈弱堿性(弱陽離子化合物)，凈化過程一般應選擇陽離子交換柱?；旌闲偷年栯x子交換柱(PCX)通過將磺酸基團(-SO3H)鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/(PEP)吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機理，并具有以下優(yōu)點：a)可通過兩種不同溶液的洗滌(水/一定pH值的緩沖溶液和有機溶劑)，使樣品更干凈，提高檢測的靈敏度。 b)批次重復性好。 c)回收率高，重現(xiàn)性好，

12、即使小柱跑干也可以得到較高回收率。 實驗部分1、 所使用的儀器和試劑：儀器：1200高效液相色譜儀 ;分析天平；小燒杯；玻璃棒；容量瓶（100ml、25ml）；膠頭滴管；量筒（10ml、25ml）；具塞刻度試管（50ml）；超聲波提取儀；離心管（10ml）；離心機;有機濾膜；微量注射器；試劑：三聚氰胺標準品( Sigma) ; 三氯乙酸、乙腈、(分析純, ) ;實驗用水為去離子水；待測乳制品（伊利奶粉）。2、 實驗步驟：1、樣品的制備參照NY/T 13722007標準的方法 4 , 準確稱取伊利奶粉5.0g四份, 其中一份加入到具塞刻度試管后，再加入1%的三氯乙酸溶液15 mL和乙腈溶液5 m

13、L, 超聲提取10 min后, 用三氯乙酸定容至刻度，混勻。靜置,將其轉(zhuǎn)移至離心管， 于30 000 r/min下離心10 min, 取離心后的上清液10 mL, 轉(zhuǎn)移至25ml的容量瓶中配成25ml的溶液，再轉(zhuǎn)移少量溶液備用用于下次待測。過0.45m濾膜, 上機測定。2、標準溶液的配制以及標準曲線的制作（已做）3、 三聚氰胺的含量根據(jù)繪制的標準曲線計算待測乳制品中三聚氰胺的含量，并使用有關軟件計算出其他有關的數(shù)據(jù)，再通過數(shù)據(jù)分析實驗，討論并得出結論。5 結果與討論（1）實驗數(shù)據(jù)結果與處理高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺的含量色譜條件：A液：0.9508 g 辛烷磺酸鈉（5 mmol/L）+

14、 1.0640 g檸檬酸（pH=3-4）用高純水品配制1L溶液；B液：甲醇；色譜條件：30%B+70%A。 色譜柱：CNWSIL C18液相色譜柱 （4.6×250mm，5 µm），檢測波長：239 nm一、 定性三聚氰胺保留時間為：15.866 min二、 定量配制一系列標準溶液，濃度分別為：0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.25 mg/ml、0.58 mg/ml、1.00 mg/ml，依次進樣，每次進樣體積為2 µl。0.000.250.500.75濃度0.01.02.03.04.0面積(x1,000,

15、000)Y = aX + ba = b = 18978.83R2 = 0.R = 0.峰號保留時間面積峰高濃度11.8941928.7360.90.0000022.0282445.2546.30.0000032.14943198.17151.70.0000042.497.016026.10.0000052.83953720.93821.20.0000063.14535308.05893.30.0000073.28841854.24932.20.0000084.0211869.0203.60.0000099.37223825.42043.90.000001012.6582362.1212.00.

16、00000空白峰號保留時間面積峰高濃度11.9021289.8248.10.0000022.0302342.3517.40.0000032.14936913.96294.80.0000042.49393291.314050.40.0000052.84941051.43060.10.0000063.13129070.85139.50.0000073.27541222.34999.80.0000083.9901363.3170.70.0000099.24220115.31783.90.000001012.4522127.0180.90.000001114.715.217928.70.0703125

17、：10峰號保留時間面積峰高濃度11.9001808.6344.80.0000022.0333059.5750.80.0000032.15154231.98725.80.0000042.506.218059.50.0000052.84754154.73738.90.0000063.13240664.07282.20.0000073.27555942.76927.70.0000083.9931861.6232.00.0000099.23428462.82502.70.000001012.4432864.3251.90.000001114.699.922380.80.0911830：10峰號保留時間

18、面積峰高濃度11.9021960.0365.10.0000022.0312814.7671.40.0000032.15050468.58242.30.0000042.503.917232.50.0000052.84552648.43750.20.0000063.13138335.86812.70.0000073.27454378.36596.60.0000083.9931639.9211.70.0000099.22526031.12348.00.000001012.4292835.2244.50.000001114.675.022081.70.0889735：10數(shù)據(jù)比較（2）討論 參考文獻 1 邵靜群，溫家琪，徐世文。三聚氰胺毒理學進展 J 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2007,12: 52-54. 2 錢中兵。三鹿嬰幼兒奶粉受三聚氰胺污染 EB /OL 。 http: / /new