殼聚糖引發(fā)植物對灰葡萄孢的防御機制（包括Avr9Cf-9快速誘導(dǎo)基因的表達）

1、殼聚糖引發(fā)植物對灰葡萄孢的防御機制（包括Avr9/Cf-9快速誘導(dǎo)基因的表達）Chitosan primes plant defence mechanisms against Botrytis cinerea, including expression of Avr9/Cf-9 rapidly-elicited genes【導(dǎo)讀】當前針對真菌病原灰葡萄孢的防控策略依賴于常規(guī)殺真菌劑和宿主遺傳抗性的組合，然而這些策略不足以保護植物免受這侵害。植物誘抗劑可以通過引發(fā)防御的現(xiàn)象來激發(fā)植物防御機制，引發(fā)導(dǎo)致病原體被宿主識別時更快和/或更強的抗性。本文旨在研究誘抗劑殼聚糖的商業(yè)配方引發(fā)的防御。殼聚糖處理

2、可導(dǎo)致茄科和蕓苔科植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性。在番茄中，增強的抗性與引發(fā)愈傷組織沉積和植物激素茉莉酸（JA）積累有關(guān)。大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組分析表明，殼聚糖在感染后更早的啟動了基因表達。此外，鑒定了2個具有特征性啟動圖譜的新基因：Avr9/Cf-9快速誘導(dǎo)蛋白75（ACRE75）和180（ACRE180）。ACRE75、ACRE180及其本生煙草同源物的過表達表明，它們是植物抗灰葡萄孢的正調(diào)節(jié)劑。本文為尋找茄科植物抵抗灰葡萄孢的策略提供了有價值的信息?！緦嶒炘O(shè)計】【結(jié)果】1 鑒定和表征新型殼聚糖制劑誘導(dǎo)灰葡萄孢的抗性測試了水溶性殼聚糖基商業(yè)制劑ChitoPlant（以下稱為殼聚糖）在誘導(dǎo)針對真菌病原體灰葡萄孢的

3、抗性方面的能力。殼聚糖的處理表明，其成功觸發(fā)了番茄（圖1a）、擬南芥（圖1b）和茄子對灰葡萄孢的抗性。在番茄中，與對照植物相比，殼聚糖在所有濃度下均顯著降低了壞死病灶的大?。▓D1a）。殼聚糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性表型在兩種高濃度（1和0.1）下具有劑量依賴性，但是，最低濃度（0.01）在0.1至1的處理中誘導(dǎo)了耐藥水平。在擬南芥中，殼聚糖處理以濃度依賴的方式誘導(dǎo)了誘導(dǎo)抗性，其中1的誘導(dǎo)抗性最強（圖1b）。進一步測試了殼聚糖是否以與其他殼聚糖制劑相似的方式誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積。在苯胺藍染色前一天，用增加濃度的殼聚糖處理植物。在兩種植物中，殼聚糖處理均直接誘導(dǎo)愈傷組織。番茄和擬南芥中的最低濃度分別為0.001和

4、0.01觸發(fā)了最強的作用（圖1c和d）。為了確定殼聚糖的抗真菌作用，在體外測試了不同濃度對灰葡萄孢菌絲生長的影響，并將其與不同濃度的殺菌劑Switch（Syngenta）進行了比較。盡管所有濃度的Switch均可阻止病原體生長，但只有0.1的殼聚糖濃度或更高濃度才具有抗真菌作用。但是，與對照相比，低殼聚糖濃度（0.01）沒有抗真菌作用，但是減少了灰葡萄孢的損害并誘導(dǎo)了愈傷組織的形成，因此選擇該濃度進行更深入的分析。圖1.殼聚糖誘導(dǎo)的番茄和擬南芥抗性的特征。（a）接種后3天番茄的病害和（b）擬南芥的病害。（n = 4-10）。（c）殼聚糖處理在番茄和（d）在擬南芥葉片噴霧處理后1天。值代表每葉面

5、積胼胝質(zhì)的的平均值±SEM（n = 8-10）。2 標記殼聚糖誘導(dǎo)抗性的防御啟動機制分析通過評估其在植物遠端誘導(dǎo)持久抗性的能力，測試了脫乙酰殼多糖引發(fā)的誘導(dǎo)抗性是否由啟動機制介導(dǎo)。番茄植物的初始處理后，用1的殼聚糖處理可誘導(dǎo)至少2周對灰葡萄孢的持久抗性（圖2a）。為了評估殼聚糖處理是否直接影響植物發(fā)育，在用1殼聚糖處理一周后測試了植物生長。這些實驗表明，殼聚糖處理觸發(fā)了顯著的生長促進，因此表明殼聚糖誘導(dǎo)的抗性不會對植物發(fā)育產(chǎn)生負面影響。為了研究殼聚糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性（IR）是否基于已知的引發(fā)機制，在感染后進行了胼胝質(zhì)和激素分布分析。與用水處理的植物相比，用殼聚糖處理導(dǎo)致胼胝質(zhì)沉積增加約

6、兩倍（圖2b、c）。此外，對防御依賴性激素的質(zhì)譜分析表明，殼聚糖誘導(dǎo)的抗性是由茉莉酸（JA）（其氨基酸共軛物JA-異亮氨酸（JA-Ile）的積累專門介導(dǎo)的。相反，未發(fā)現(xiàn)其他防御激素如水楊酸（SA）和脫落酸（ABA）的濃度受到其他影響（圖2d）。因此，殼聚糖-IR基于誘導(dǎo)感染部位的愈傷組織以及JA及JA-Ile的積累。圖2.殼聚糖的誘導(dǎo)抗性是基于引發(fā)的。（a）用水（對照）或1脫乙酰殼多糖處理后2周，接種后3天（dpi），番茄的病害。（n = 8）。（b）與灰葡萄孢感染后1天的真菌病變直徑相比，水（對照）和脫乙酰殼多糖（0.01）處理的植物中在感染部位胼胝質(zhì)沉積的百分比。（n = 4）。（c）在感

7、染部位殼聚糖誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)代表性圖片。藍色對應(yīng)于真菌的生長，而黃色對應(yīng)于在感染部位的胼胝質(zhì)沉積。比例尺= 0.5毫米。（d）感染后24h的水楊酸（SA），茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）的質(zhì)譜定量（ng / mL）。值表示平均值±SEM（n = 4）。3 殼聚糖誘導(dǎo)抗性的轉(zhuǎn)錄分析基因表達的啟動通常遵循一種特征模式：僅用激發(fā)子處理后（即殼聚糖+對照），差異表達低，短暫或無法檢測到，與未用化學(xué)試劑預(yù)處理的受感染植物（即水+灰葡萄孢）相比，差異表達在隨后的感染后（殼聚糖+灰葡萄孢）增強。為了進一步確定殼聚糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性的基礎(chǔ)，本文在灰葡萄孢感染后（hpi）的第6、9和12小時進行了完整的轉(zhuǎn)

8、錄組分析。在感染后的不同小時進行主成分分析（PCA）表明，殼聚糖處理并未觸發(fā)轉(zhuǎn)錄的變化，但是灰葡萄孢的感染極大地影響了實驗（圖3a）。此外，盡管在9和12 hpi時可以觀察到對照和灰葡萄孢感染的重復(fù)之間存在分離，但在6 hpi的早期時間點PCA中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。在所有三個處理和時間點中鑒定出1,722個差異表達基因（DEG）。與第一個時間點的水+對照處理相比，分層聚類將基因分為四個粗略的組（6 hpi，圖3b）：聚類簇i由受到灰葡萄孢菌感染抑制的基因組成；簇ii代表僅通過殼聚糖處理誘導(dǎo)的基因；簇iii包括在以后的時間點受灰葡萄孢感染和殼聚糖處理所抑制的基因；簇iv在以后的時間點受灰葡萄孢感

9、染和殼聚糖處理所誘導(dǎo)的基因（圖3b）。總體模式與先前的發(fā)現(xiàn)一致，即與殼聚糖處理相比，灰葡萄孢感染對番茄的轉(zhuǎn)錄具有大規(guī)模、更廣泛差異的反應(yīng)（圖3a）。此外分析表明，殼聚糖的應(yīng)用導(dǎo)致抑制的基因數(shù)量比誘導(dǎo)的基因更高，除了簇iv中一些高度誘導(dǎo)的基因外。殼聚糖處理與灰葡萄孢感染相比有明顯差異?；移咸焰咴?和12 h差異誘導(dǎo)了簇iv中的一大批基因，以及簇i中病原體所抑制的一大批基因。這表明殼聚糖是一種引發(fā)劑，不會直接觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的主要作用。為了研究負責(zé)引發(fā)殼聚糖抗灰葡萄孢的不同信號傳導(dǎo)途徑和特定基因，雙向方差two-way ANOVA分析確定了所有三種處理和時間點之間的8,471個差異表達基因（DEG）。

10、韋恩圖表明，殼聚糖自身的作用不會觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄的重大變化：殼聚糖+對照，水和對照處理分別在6、9和12 hpi差異表達15、36和20個基因（圖3c）。但是在植物感染灰葡萄孢后，殼聚糖的作用更為明顯。這種組合導(dǎo)致分別在6、9和12 hpi時分別產(chǎn)生543、2,011和2,967個基因的差異表達，其中僅在殼聚糖、灰葡萄孢處理中誘導(dǎo)了260、991和723個DEG（圖3c）。相比之下，水+灰葡萄孢處理分別在6、9和12 hpi分別顯示327、1,134和2,697個基因的差異表達，其中70、116和501個DEGs對水+灰葡萄孢處理具有特異性（圖3c）。這些結(jié)果表明，存在一些可能負責(zé)殼聚糖誘導(dǎo)的啟動

11、反應(yīng)的基因，導(dǎo)致對灰葡萄孢的更快和更強效的響應(yīng)。為了進一步鑒定參與殼聚糖誘導(dǎo)的啟動反應(yīng)的早期信號通路和基因，對與僅在殼聚糖+灰霉病處理后6 h差異表達的260個基因進行了進一步分析。對于生物過程，諸如刺激、化學(xué)和生長素反應(yīng)等途徑被過度代表（表1）。此外，對于分子功能、半胱氨酸型肽酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性基因富集（表1）。圖3.殼聚糖誘導(dǎo)的對灰葡萄孢的抗性的轉(zhuǎn)錄組分析。（a）在感染（hpi）后6、9和12小時對整個轉(zhuǎn)錄組進行主成分分析（PCA）。（b）差異表達基因的熱圖（2-way ANOVA p <0.01）。顯示了與水+對照相比，用殼聚糖+/-處

12、理和在6、9、12 hpi對數(shù)倍數(shù)誘導(dǎo)（紅色）或抑制（藍色）的灰葡萄孢感染的概況。表達譜上的層次聚類大致分為i、ii、iii、iv。（c）差異表達基因的統(tǒng)計顯著性數(shù)據(jù)集（2-way ANOVA p <0.01）的維恩圖。對三種測試處理方法進行成對T檢驗比較（火山圖：p <0.05，2倍臨界值）。表1.富集基因的生物學(xué)過程和分子功能。4 殼聚糖啟動基因的鑒定首先，對9個基因的子集進行qRT-PCR分析，驗證轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)。選擇在最早時間點（6 hpi）受到差異調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本，以鑒定參與早期免疫反應(yīng)的啟動基因。在水+對照、殼聚糖+對照和水+灰葡萄孢上分析了殼聚糖+灰葡萄孢在6 hpi時獨

13、特的260 DEG子集的表達（圖3c）。從該子集中，發(fā)現(xiàn)203個下調(diào)基因和57個基因上調(diào)基因。在感染過程中被抑制的203個基因中，有11個轉(zhuǎn)錄物與半胱氨酸型肽酶活性有關(guān)。其他轉(zhuǎn)錄本與光合作用、光系統(tǒng)I活動中的光收集分組聚類在一起。而且有些對激素的活性有反應(yīng)。與水+灰葡萄孢相比，9個乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子和受體基因從-2,3顯著下調(diào)至-1,1。其他具有強大啟動功能的著名基因包括具有蛋白水解活性的基因，其抑制范圍為-3至-1,7倍。其他表達受抑制的基因?qū)儆谥参锷L素激素、ABA受體（ABAPYL4）。此外，兩個鮮為人知的橫向器官邊界（LOB）基因受抑制。在57個差異表達上調(diào)的基因中，編碼過氧化物酶活性的

14、1個轉(zhuǎn)錄物比水+灰葡萄孢增加了2倍，編碼蛋白激酶活性的9個轉(zhuǎn)錄物編碼了+1,1到+2,1倍。還有編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的5個轉(zhuǎn)錄物，包括SlMYB20、SLWRKY51和SlWRKY72。重要的是，未表征的基因也顯示了啟動表達模式。其中，在6 hpi時Avr9 / Cf-9快速誘導(dǎo)蛋白75（ACRE75；Solyc11g010250.1）在殼聚糖+灰葡萄孢中比的水+灰葡萄孢中上調(diào)了1.6倍。先前已經(jīng)研究了ACRE基因參與R基因介導(dǎo)且不依賴ROS基因的早期植物防御反應(yīng)和茉莉酸甲酯（MeJA）處理的反應(yīng)。ACRE75分子的功能仍有待進一步研究，因此進一步研究了其功能以及ACRE基因家族其他成員在殼聚糖防

15、御啟動中的作用。5 ACRE基因在灰葡萄孢誘導(dǎo)抗性中的作用為了研究ACRE基因家族的其他成員是否顯示與ACRE75類似的啟動圖譜，對在6 hpi差異表達的基因子集進行了相關(guān)分析。鑒定出具有統(tǒng)計學(xué)上顯著相似特征的基因，其中包括置信值為0.956的ACRE180。此外，在實驗的后期對樣品進行分析，確認ACRE75和ACRE180均在隨后的時間點被啟動。為了研究ACRE75和ACRE180基因的啟動表達是否可能與增強的抗病性有關(guān)，對番茄及本氏煙草同源基因進行過表達。對于SlaCRE75，本氏煙草基因組中最佳匹配是Niben101Scf03108g12002.1（稱為NbACRE75），具有77.5的

16、蛋白質(zhì)一致性。對于SlaCRE180，本氏煙草的基因組中最佳匹配是Niben101Scf12017g01005.1（稱為NbACRE180），具有49.5的蛋白質(zhì)一致性。擬南芥直系同源物分析未能鑒定出ACRE75和ACRE180基因。對本氏煙草中通過融合GFP熒光分析蛋白質(zhì)的亞細胞位置。將過表達的載體與RFP標記pFlub載體共同浸潤到本氏煙草CB157（核mRFP標記）和CB172（ER mRFP標記）中。顯示游離的GFP積累在細胞質(zhì)和細胞核中，而GFP-S1ACRE75和GFP-NbACRE75融合蛋白僅積累在本氏煙草細胞的細胞核和核仁中。此外，GFP-S1ACRE180融合僅在ER中積累

17、，而GFP-NbACRE180融合僅在過氧化物酶體中積累。為了進一步研究ACRE基因的過表達對抗性的影響，將4個含有GFP-SlACRE75、GFP-S1ACRE180、GFP-NbACRE75和GFP-NbACRE180以及GFP空載體（EV）的載體注入本氏煙草后感染灰葡萄孢。殼聚糖誘導(dǎo)的針對灰葡萄孢的抗性被證明是有效的（圖4a）。與EV對照相比，所有注入GFP-S1ACRE75、GFP-SlaCRE180、GFP-NbACRE75和GFP-NbACRE180的本氏煙草葉片均顯示出灰葡萄孢壞死病灶大小的顯著降低（圖4b）。為了進一步分析ACRE75和ACRE180的生物學(xué)功能并確認其在植物對

18、灰葡萄孢的抗性中的作用，將擬南芥植物轉(zhuǎn)化為組成型過表達GFP-S1ACRE75、GFP-S1ACRE180、GFP-NbACRE75和GFP-NbACRE180。與Col-0和GFP-EV對照相比，轉(zhuǎn)基因GFP-S1ACRE75、GFP-S1ACRE180、GFP-NbACRE180和GFP-NbACRE75過表達植物均顯示出增強的抗性表型，且灰葡萄孢壞死病灶大小明顯降低（圖4c）。此外，在6 dpi時，GFP-S1ACRE75及其同系物GFP-NbACRE75過表達植物顯示出對灰葡萄孢的抗性高于GFP-S1ACRE180和GFP-NbACRE180過表達株（圖4c）。圖4. ACRE基因的功

19、能表征。（a）殼聚糖對本氏煙草的誘導(dǎo)抗性。接種后2天（dpi）的病灶。值代表平均值±SEM（n = 18）。（b）瞬時表達組成活性SlaCRE75、SlaCRE180、NbACRE75和NbACRE180的本氏煙草感染灰葡萄孢的壞死病灶。在感染后4天進行病變大小測量。（c）穩(wěn)定過表達的SlaCRE75、SlaCRE180、NbACRE75和NbACRE180的擬南芥感染灰葡萄孢的壞死病灶。在接種后6天（dpi）測量病變大小。【討論】本文評估了殼聚糖在不同植物物種中誘導(dǎo)對灰葡萄孢的抗性的能力，并將其作用與防御機制的啟動聯(lián)系起來。殼聚糖處理在一定濃度范圍內(nèi)導(dǎo)致了番茄圖1a）、擬南芥（圖1

20、b）和本氏煙草（圖4a）的誘導(dǎo)抗性，表明存在與真菌PAMP的反應(yīng)類似的防御作用。此外，殼聚糖處理可激活基礎(chǔ)抗性過程，例如胼胝質(zhì)在細胞壁上的沉積（圖1c、d），這被認為是抵抗病原體入侵的重要因素。在擬南芥中抗性的表達取決于使用的殼聚糖濃度。相反，在番茄和茄子中，抗性水平不取決于殼聚糖的濃度。此外，殼聚糖誘導(dǎo)的番茄和擬南芥中的愈傷組織沉積沒有遵循經(jīng)典的劑量反應(yīng)曲線，激活愈傷組織的最有效方法是降低激發(fā)子的濃度（圖1c、d）。有研究表明其他引發(fā)劑在較低濃度下會引發(fā)誘導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性現(xiàn)象，高劑量的MeJA對生理過程具有有害影響，并且總體上降低了保護效率。這與低濃度的殼聚糖不會直接影響病原體生長的觀察結(jié)果一致

21、，殼聚糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性的作用存在濃度閾值。殼聚糖的葉面施用已被廣泛用于控制由多種害蟲和病原體引起的疾病發(fā)展。然而，很少有研究研究殼聚糖作為引發(fā)劑的作用，并且大多數(shù)研究都集中在其作為種子的用途上，主要是為了改善發(fā)芽和產(chǎn)量。本文表明殼聚糖誘導(dǎo)的抗性是基于防御機制的啟動。本文表明殼聚糖誘導(dǎo)的抗性與生長減慢無關(guān)，在處理后至少兩周是持久的且可維持的（圖2a），這是基于愈傷組織更強的JA（圖2d）和JA-ile的積累。這些結(jié)果表明，殼聚糖處理后的真菌生長停滯不是直接由化學(xué)物質(zhì)的毒性作用介導(dǎo)的。此外，這些結(jié)果證明了殼聚糖處理后與其他引發(fā)劑（包括Hx）具有相似的啟動機制。有趣的是，盡管有許多報道說植物激素之間

22、存在拮抗和其他串擾相互作用，但SA和ABA的濃度并未受到影響。這表明殼聚糖的防御啟動不會導(dǎo)致其他激素依賴性信號通路的下調(diào)，從而可能保持對其他壓力的有效抗性。為了進一步探討防御的啟動作用并揭示殼聚糖誘導(dǎo)的抗性背后的轉(zhuǎn)錄機制，本文進行了轉(zhuǎn)錄組分析。使用與防御啟動相關(guān)但沒有直接抗菌作用的殼聚糖濃度，確定了早期作用的差異轉(zhuǎn)錄組變化。結(jié)果表明，殼聚糖處理不會導(dǎo)致主要的轉(zhuǎn)錄變化（圖3a）。相比之下，水+對照和殼聚糖+灰葡萄孢的處理比較表明DEG數(shù)量更多（圖3b、c），因此表明植物對激發(fā)子的啟動特性做出了反應(yīng)。在6hpi時，殼聚糖+灰葡萄孢DEG的下調(diào)數(shù)量是上調(diào)的3倍以上（203下調(diào)、57上調(diào)）。這表明番茄

23、植株可能會抑制易感因素，以減少灰葡萄孢對宿主防御的操縱。有趣的是，一些下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本編碼半胱氨酸型肽酶。據(jù)報道這些蛋白在抵抗病原體包括灰葡萄孢中具有作用。其他下調(diào)的基因與植物激素活性有關(guān)。包括乙烯AP2 / ERF轉(zhuǎn)錄因子和ABA PYL受體（SlABAPYL4），據(jù)報道它們參與了防御反應(yīng)，充當JA / ET依賴性抗灰葡萄孢防御的正或負調(diào)節(jié)劑。上調(diào)的基因包括編碼過氧化物酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的轉(zhuǎn)錄物，例如過氧化物酶5、SlMYB20、SLWRKY51和SlWRKY72，具有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NAC結(jié)構(gòu)域蛋白的CONSTANS樣蛋白以及涉及蛋白降解的RING型E3泛素轉(zhuǎn)移酶。這些基因與防御反應(yīng)有關(guān)。重要的是，最近關(guān)于擬南芥中殼聚糖寡糖對細菌病原體丁香假單胞菌的啟動作用的研究也揭示了類似信號通路在抗性表達中的作用?？偠灾?，這