質(zhì)粒DNA提取定量酶切與PCR鑒定實驗報告

1、質(zhì)粒dna提取定量酶切與pcr鑒定實驗報告 粒 質(zhì)粒 dna 的提取、定量、酶切與 pcr 判定 一、 實驗?zāi)康?1.學(xué)習(xí)并掌握用堿裂解法提取質(zhì)粒 dna 的要領(lǐng)； 2.學(xué)習(xí)并掌握了解質(zhì)粒酶切判定的要領(lǐng)； 3.學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收檢測 dna 濃度和純度的原理和要領(lǐng)； 4.學(xué)習(xí)并掌握 pcr 基因擴(kuò)增的實驗原理和操縱要領(lǐng)； 5.學(xué)習(xí)并掌握水平式瓊脂糖凝膠電泳的原理和使用要領(lǐng)。 二、 實驗原理 1.pcr(多聚酶鏈?zhǔn)椒错? 在 dna 聚合酶催化下，可以 dna 為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以 dntp 為原料，通過變性、退火、延伸等步調(diào)， 在體外（緩沖液中）復(fù)制 dna，使目的 dna 按 2

2、 n 方法呈指數(shù)形式擴(kuò)增。 pcr 一次循環(huán)的具體反響步調(diào)為： a.變性：加熱反響系統(tǒng)至 95，使模板 dna 在高溫下完全變性，雙鏈解鏈 。 b.退火：逐漸低落溶液溫度，使合成引物在低溫（3570,一般低于模板 tm 值的 5左右），與模板 dna 互補(bǔ)退火形成部分雙鏈。 c.延伸：溶液反響溫度升至中溫 72，在 taq 酶作用下，以 dntp 為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板 dna 的一條單鏈在解鏈和退火之后延伸為一條雙鏈。 2.質(zhì)粒 dna 的提取與制備 (1).堿裂解法： 染色體 dna 與質(zhì)粒 dna 的變性與復(fù)性存在差別： a.高堿性條件下，染色體 dna 和質(zhì)粒 dna 均變性；

3、b.當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)治其 ph 值至中性時，變性的質(zhì)粒 dna 復(fù)性并生存在溶液中，染色體 dna 不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可通過離心形成沉沉淀去除。 (2).離心層析柱： a.硅基質(zhì)膜在高鹽、低 ph 值狀態(tài)下可選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 dna，而不吸附溶液中的卵白質(zhì)和多糖等物質(zhì)； b.通已往卵白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌身分去除； c.低鹽，高 ph 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 dna 從硅基質(zhì)膜上洗脫。 3.質(zhì)粒 dna 的定量闡發(fā)（紫外分光光度法）： a.物質(zhì)在光的照射下會產(chǎn)生對光的吸收效應(yīng)，且其對光的吸收是具有選擇性； b.種種差別的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜: dna 分對波長

4、 260nm 的紫外光有特異的吸收峰 卵白質(zhì)對波長 280nm 的紫外光有特異的吸收峰 碳水化合物對 230nm 的紫外光有特異的吸收峰 c.a260/a280 及 a260/a230 的比值可以反響 dna 的純度； a260/a280=1.8 dna 純凈 a260/a2801.8 體現(xiàn)樣品中含卵白質(zhì)（芳香族）或酚類物質(zhì) a260/a2801.8 含 rna 雜質(zhì)，用 rna 酶去除。 4.質(zhì)粒 dna 的酶切判定： 限制性內(nèi)切酶是 dna 重組操縱歷程中所使用的根本東西。限制性內(nèi)切酶能特異性地與一段被稱為限制酶識別序列的特殊 dna 序列結(jié)合，或是與其四周的特異位點(diǎn)結(jié)合，并在結(jié)合位點(diǎn)切割

5、雙鏈 dna。 5.瓊脂糖凝膠電泳： 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的巨細(xì)決定于瓊脂糖的濃度。 dna 分子在堿性情況中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。 dna 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)：差別的 dna，分子量巨細(xì)及構(gòu)型差別，電泳時的泳動率就差別，從而分出差別的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比干系). 三、 質(zhì)料與要領(lǐng)： ： （ 一 ） 實驗質(zhì)料： ： 1.pcr 儀器：pcr 儀、臺式離心機(jī)、微量加樣槍、滅菌的薄壁離心管 質(zhì)料：菌液【大腸桿菌 dh5a 菌株(pmd19-t 質(zhì)粒,含目的片段-綠色熒光卵白 gfp)】、無菌去

6、離子水、2premix taq、引物 2. 質(zhì)粒 dna 的提取與制備 儀器：恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、離心層析柱、eppendorf 管、微量加樣槍、離心管 質(zhì)料：溶液 p1（s1）、溶液 p2 (s2）、溶液 p3（s3）、去卵白液 pe（w1）漂洗液wb（w2）、洗脫液 eb（eluent)、含 pmd19-t 質(zhì)粒的大腸桿菌 dh5 3. 質(zhì)粒 dna 的定量（紫外分光光度法） 儀器：比色杯、紫外分光光度計、微量加樣槍 質(zhì)料：蒸餾水、質(zhì)粒 4.質(zhì)粒 dna 的酶切判定 儀器：1.5ml 的 ep 管、微量加樣槍 質(zhì)料：無菌水、10m 酶切緩沖液 buf r、質(zhì)粒 dna、hind iii

7、 (15u/ul)、ecor i(12u/ul) 5.瓊脂糖凝膠電泳 儀器：凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng) 質(zhì)料：電泳指示劑、gelview、tbe、瓊脂糖、dna marker 5000、電泳緩沖液 （ 二）實驗要領(lǐng) 1. .pcr 2 . . 質(zhì)粒 dna 的提取與制備 準(zhǔn)備目的 dna：菌液煮沸 10min，冷凍，室溫解凍后離心取上清液 取 0.2 ml pcr 反響管一只，用微量加樣槍按下述順序分別參加：滅菌去離子水5.5l、2*premix taq12.5l、引物 1 (10 mol/l) 1l、引物 2 (10 mol/l) 1l、菌液 5l 將裝有 pcr 反響體系的 pcr 反響管

8、放入 pcr 儀上進(jìn)行如下操縱： 94預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán) 循環(huán)為9430 秒，5030 秒，72 1 分鐘。循環(huán)為 30 次 72 5 分鐘 4 保溫 取 1.5ml 培養(yǎng)物參加 eppendorf 管中 將擴(kuò)增后的基因用微量加樣槍加到電泳儀的凝膠孔中 13000rpm x 1min，棄上清 將 pcr 反響管置臺式離心機(jī)中瞬時離心 3 . 質(zhì)粒 dna 的定量（紫外分光光度法） 參加 250l 溶液 s1，吹打，使細(xì)菌沉淀疏散，徹底懸浮 參加 250l 溶液 s2，顛倒 46 次混勻（不要劇烈振蕩），直到溶液變得清亮 參加 350l 溶液 s3，立即溫和混勻 68 次。13000rp

9、m 離心 10min，小心取上清液（500-800l ） 將吸附柱放于收集管中，將上一步所得上清液參加吸附柱中，13000rpm 離心 3min，棄濾液 參加 500l 去卵白液(w1)，13000rpm 離心 1min，棄濾液 向吸附柱中參加 700l 漂洗液 w2， 13000rpm 離心 1min ，棄濾液；重復(fù)一遍 空柱 13000rpm 離心 1min，然后室溫安排 3min，使殘留乙醇揮發(fā) 取出吸附柱，放入一個潔凈的離心管中，在吸附膜的中間加 50l 洗脫緩沖液(eluent)，室溫安排 1min，13000rpm 離心 1min 洗脫質(zhì)粒 dna， -20生存?zhèn)溆?清洗比色皿：用

10、微量加樣槍向比色皿參加適量的蒸餾水刷洗，23 次。并用濾紙擦拭潔凈 空白比較比色測定 向比色皿參加 98ul 蒸餾水，進(jìn)行 blank 調(diào)零 再向比色皿參加 2ul 的質(zhì)粒 dna，于紫外分光光度計上進(jìn)行sample測定，記錄相關(guān)數(shù)據(jù) 4 . . 質(zhì)粒 dna 的酶切判定 5 . 瓊脂糖凝膠電泳 四、 結(jié)果與討論 ： （一）實驗現(xiàn)象 1.參加溶液 p1，出現(xiàn)懸表現(xiàn)象； 2.參加溶液 p2,溫和混勻，溶液會變得清亮； 在一個潔凈的 1.5mlep 管中按順序依次參加下述試劑 無菌水 9.0l、10m 酶切緩沖液 2.0l、 質(zhì)粒 dna 7.0l、 hind iii (15u/ul) 1.0l、

11、 ecor i (12u/ul) 1.0l 小心混勻試劑，將 ep 管置于恒溫水浴箱中 371.5 小時。 取質(zhì)粒 dna、經(jīng)酶切反響后的 dna 片段和 pcr擴(kuò)增的 dna 各 6l 于三個 ep 管中并做好標(biāo)記 往每個 ep 管中參加 1lgelview 染料，室溫安排一分鐘 用微量加樣槍分別各吸取 10ul，按序號參加到電泳儀的凝膠孔中 電泳 30 分鐘 取出凝膠 紫外光下視察，拍照 3.參加溶液 p3,有白色絮狀沉淀生成； 4.電泳時，可視察到在電流作用下，點(diǎn)樣的溶液出現(xiàn)電泳現(xiàn)象，電泳速度差別。 在紫外檢測儀條件下，可以視察到差別的物質(zhì)出現(xiàn)差別的電泳帶。 （二）實驗結(jié)果 原始實驗數(shù)據(jù)

12、 丈量次數(shù) 質(zhì)粒 dna 濃度（ug/ml） ratio 比值(a260/a280) 1 148 1.46 2 106 1.52 3 115 1.45 平均值 123 1.47 電泳后的圖片 a:pcr 目的條帶 b:酶切片段 c:質(zhì)粒 dna （四）實驗闡發(fā) 1.由上數(shù)據(jù)可知，ratio=1.47 a260/a2801.8 表明樣品中含有較多的卵白質(zhì)（芳香族） 2. 在圖片中，其他三類 dna 與 maker 相比力，可知質(zhì)粒 dna 的分子巨細(xì)在 2500bp-3500bp，酶切反響的質(zhì)粒 dna 片段分子巨細(xì)在 2800-3000bp 和 400-500 左右，pcr 的 dna 分子巨

13、細(xì)在 400-500bp。根本切合預(yù)期。 （四）實驗討論 1.質(zhì)粒 dna 中出現(xiàn)三條帶，分別對應(yīng)超螺旋質(zhì)粒 dna、線性 dna 和開環(huán)狀質(zhì)粒 dna。這三種差別構(gòu)型的分子有差別的遷移率，在一般情況下，遷移速度最快的為超螺旋型，其次為線性分子，最慢的為開環(huán)狀分子，所以條帶從上到下分別為：超螺旋型 dna、線性分子、開環(huán)狀分子。, 2.對付實驗結(jié)果中：a260/a2801.8 的可能原因為： a.在質(zhì)粒 dna 的提取實驗的"取上清液'步調(diào)中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多的卵白雜質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)實驗中因卵白質(zhì)量較多而難以去除。 b.可能為試劑污染引起雜質(zhì)卵白的引入。 3.實驗中需注意的

14、事項： 用微量加樣槍加試劑時，同種試劑可以不消換吸頭，每次換差別試劑時要記得換一個新吸頭。 在 pcr 中，如果配好的反響液較多沾到管壁上，要將 pcr 反響管置臺式離心機(jī)中瞬時離心，使反響液會合于管底，然后才將反響管放到基因擴(kuò)增儀上。 在質(zhì)粒 dna 提取的實驗中，參加溶液 s2 時，時間不能太久，行動要溫柔，輕輕顛倒頻頻。 在電泳實驗中，點(diǎn)樣時槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡。 在電泳中，geldview 有毒，切勿用手打仗。 思考題： （1）堿裂解法提取質(zhì)粒時，溶液 i、ii、iii 的作用分別為？ 答： 溶液 i：螯合金屬離子，抑制脫氧核酸酶對 dna 的降解作用；有利于溶酶體的作用。 溶液 ii：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和卵白質(zhì)變性。 溶液 iii：酸性條件下質(zhì)粒 dna 復(fù)性，變性卵白-sds+線性 dna 沉淀，na+可中和 dna。 （