雙抗體夾心法

1、1 .雙抗體夾心法雙抗體夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。它是檢測(cè)抗原最常用的ELISA ,適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待測(cè)抗原是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成正比（在方法可檢測(cè)范圍內(nèi)）。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量 （OD值），即可確定待測(cè)抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)不同的抗原決定簇結(jié)合，

2、則屬于雙位點(diǎn)夾心法。若采用固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測(cè)抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法。操作步驟：將特異性抗體包被固相載體McAb o孵育一定時(shí)間，使形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。加待檢標(biāo)本，孵育，使標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原 抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。加酶標(biāo)抗體，孵育，使形成固相抗體 -待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié) 合酶標(biāo)抗體。加底物顯色。固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過比色，測(cè)標(biāo)本中抗原的量?，F(xiàn)多采用針對(duì)單一抗原決定簇特異性的單克隆抗體做固相化和酶標(biāo)抗體，則受檢樣品和酶標(biāo)抗體可一次性加入， 簡(jiǎn)化流程，縮短反應(yīng)時(shí)

3、間。若標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度過高，抗原可分別與酶標(biāo)抗體和固相抗體結(jié)合而不形成上述夾心復(fù)合物（類似于免疫沉淀反應(yīng)中抗原過剩時(shí)的后帶現(xiàn)象），使最終結(jié)果低于實(shí)際含量（鉤狀效應(yīng)），甚至出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。 因此對(duì)此類標(biāo)本 應(yīng)適當(dāng)稀釋后再測(cè)定。另外，當(dāng)血清中存在類風(fēng)濕因子（RF）時(shí)，類風(fēng)濕因子（RF）可充當(dāng)抗原，而形成固相抗體 -類風(fēng)濕因子-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2 .間接法此法是測(cè)定抗體最常用的方法 ，屬非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。 其原理是將抗原連接到固相載體上， 樣品中待測(cè)抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗（針對(duì)受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體）與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成

4、固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測(cè)定加底物后的顯色程度，確定待測(cè)抗體含量。操作步驟將已知抗原包被固相載體，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。封閉：用高濃度無關(guān)蛋白封閉，阻止待檢血清中非特異 IgG吸附固相。加待檢血清，孵育，使固相抗原和待檢抗體充分結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的非特異抗體及其他血清成分。加酶標(biāo)抗體或酶標(biāo) SPA,孵育，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗抗體（或酶標(biāo)SPA）復(fù) 合物。加底物顯色。間接法由于采用的酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子（如抗人IgG）,因此該法只需要換固相抗原，即可用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣泛的通用性。3 .競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA可用

5、于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)。其方法和特點(diǎn) 是：酶標(biāo)記抗原（抗體）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)體中的非標(biāo)記抗原或抗體具有相同的與固相抗體（抗原）結(jié)合的能力；反應(yīng)體系中，固相抗體（抗原）和酶標(biāo)抗原（抗體）是固定限量，且前 者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記抗原（抗體）的分子量和；免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相載體上復(fù)合物中被測(cè)定的酶標(biāo)抗原（抗體）的量（酶活性）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中非標(biāo)記抗原（抗 體）的濃度成反比。操作步驟將已知抗體包被載體，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合物。加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原，孵育，使兩者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。洗滌除去未結(jié)合到固相上的游離酶標(biāo)抗原及其他未結(jié)合物。加底物顯色。顏色深淺與待測(cè)抗原量成

6、反比。同理，也可用固相抗原和酶標(biāo)抗體作試劑，使固相抗原和標(biāo)本中的待檢抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體。待檢抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制酶標(biāo)抗體和固相抗原結(jié)合，即待檢抗原越多，顯色越淺。以抗原測(cè)定為例，先將特異性抗體連接于固相載體，分別設(shè)置對(duì)照管和樣品測(cè)定管；對(duì)照管中僅加酶標(biāo)抗原，加樣后，無非標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)，酶標(biāo)抗原即與固相抗體充分結(jié)合；而測(cè)定管抗原與后者的結(jié)合受到抑制而減少。加酶底物顯色后，對(duì)照管因固相抗體上結(jié)合的酶標(biāo)抗原多，顯色深，測(cè)定管則依被檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗體程度不同而顯色深淺有 異：被檢抗原多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合少，底物顯色反應(yīng)弱，色淺；反之呈色深。即結(jié) 合于固相的酶標(biāo)抗原量與樣品中被檢抗原濃度負(fù)相

7、關(guān)。計(jì)算測(cè)定管與對(duì)照管顏色深度（OD值）之差，即可確定被檢抗原量。4 .捕獲法捕獲法（亦稱反向間接法） ELISA ,主要用于血清中某種抗體亞型成分（如 IgM）的 測(cè)定。以目前最常用的IgM測(cè)定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM和IgG同時(shí)存在，則后者可干擾IgM的測(cè)定。因此捕獲法的工作原理設(shè)計(jì)為：先將針對(duì)IgM的第二抗體（如羊抗人IgM科鏈抗體）連接于固相載體，用以結(jié)合（“捕獲”）樣品中所有IgM （特異或 非特異），洗滌出去IgG等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異抗原與待檢IgM結(jié)合；再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物作用顯色后， 即可對(duì) 樣品

8、中待檢IgM是否存在及其含量進(jìn)行測(cè)定。5 .其他ELSAELSA法由于測(cè)定靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，且無放射性污染等諸多優(yōu)點(diǎn)， 使其不僅成為目前應(yīng)用最廣而且發(fā)展最快的一種免疫測(cè)定技術(shù)。而且在方法學(xué)上的改進(jìn)和衍化，使其不斷有各具特點(diǎn)的新測(cè)定法問世，如應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)（biotin-axidinsystem, BAS）的ELISA ;利用酶催化底物發(fā)熒光的酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定（ enzyme linked immunofluorecence assay, ELFIA ）,斑點(diǎn)-ELISA （dot-ELISA ）和酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法 （enzyme linked immunoele

9、ctrotransfer blot, EITB ）以及酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光測(cè)定（ enzyme linked immunochemiluminescence assay , ELICLA ）等。新方法不僅進(jìn)一步提高了測(cè)定靈敏、 特異性，而且使 ELISA技術(shù)在提高自動(dòng)化程度的同時(shí)，也便于單份樣本測(cè)定和簡(jiǎn)化設(shè)備條 件，尤其試用于急診、社區(qū)診所及家庭化驗(yàn)。膜載體的酶免疫測(cè)定固相膜免疫測(cè)定（solid phase membrane-based immuoassay ）與固相酶免疫測(cè)定 （ELISA ） 相類似，其特點(diǎn)是以微孔膜作為固相。標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子，如彩色乳膠、膠體金、膠體硒等，以紅色的

10、膠體金最為常用。固相膜的特點(diǎn)在于其多孔性，像濾紙一樣。固相 膜可被液體穿過流出，液體也可以通過毛細(xì)管作用在膜上向前移行。利用這種性能建立了兩種不同類型的快速檢測(cè)方法。常用的固相膜為硝酸纖維素（ nitrocellulose , NC）膜。斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)-ELISA （ dot-ELISA ）實(shí)驗(yàn)原理與常規(guī)的 ELISA相同，不同之處在于斑點(diǎn) -ELISA 所用載體為蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)吸附力（近100%）的硝酸纖維素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使 NC染色實(shí)驗(yàn)方法為：加少量（12“）抗原于膜上，由于 NC膜 吸附能力強(qiáng)，故需在干燥后進(jìn)行封閉；然后滴加樣品血清，其中的待檢抗體

11、即與NC膜上抗原結(jié)合；洗滌后再滴加酶標(biāo)二抗， 最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP標(biāo)記物，常用二氨基聯(lián)苯胺）；陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點(diǎn)。斑點(diǎn) -ELISA的優(yōu)點(diǎn)為： NC膜吸附蛋白力強(qiáng)，微量抗原吸附完全，故檢出靈敏度可較普通ELISA高68倍；試劑用量教ELISA節(jié)約約10倍；操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判斷不需特殊設(shè)備條件；吸附抗原（抗 體）或已有結(jié)果的 NC膜可長(zhǎng)期保存（-20 C可長(zhǎng)達(dá)半年），不影響其活性。免疫滲濾實(shí)驗(yàn)免疫滲濾實(shí)驗(yàn)（IFA）的基本原理是：一硝酸纖維素（NC）膜為載體，利用微孔濾膜的 可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完

12、成。 免疫滲濾實(shí)驗(yàn)最初是從斑點(diǎn)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展建立起來的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標(biāo)記的。20世紀(jì)90年代初發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物的金免疫滲濾實(shí)驗(yàn)（ GIFA）,省卻了酶對(duì)底物的反 應(yīng)，更加簡(jiǎn)單、快速。滲濾裝置是 IFA中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水塑料和 點(diǎn)加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分著稱。塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中 央有一直徑約為 0.40.8cm的小圓吸孔，盒內(nèi)墊放吸水塑料，NC膜片安放在正對(duì)盒蓋的圓孔下，緊密關(guān)閉盒蓋， 是NC膜片貼緊水塑料。如此即制備成一滲濾裝置。整個(gè)反應(yīng)過程都在滲濾裝置中進(jìn)行，因此又常稱位扁平長(zhǎng)方形滲濾裝置為反應(yīng)板。以雙抗體夾心HCG為例，于小孔

13、內(nèi)滴加標(biāo)本12滴，待完全滲入。此時(shí)標(biāo)本中的HCG 與NC膜上的抗3 HCG相結(jié)合。再于小孔內(nèi)滴加結(jié)合物試劑12滴，待完全滲入，金標(biāo)記的抗a HCG抗體與NC膜上的HCG形成雙抗體夾心復(fù)合物。因膠體金為紅色， 在NC膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點(diǎn)顯示者判斷為陽性反應(yīng)；反之，則為 陰性反應(yīng)，斑點(diǎn)呈色的深淺相應(yīng)地提示陽性強(qiáng)度。有將包被斑點(diǎn)由圓點(diǎn)式改成短線條式的： 質(zhì)控斑點(diǎn)橫向包被成橫線條，如"反應(yīng)斑點(diǎn)縱向包被成豎線條，如“ I ”；兩者相交成“+”。這樣，陽性反應(yīng)結(jié)果在膜上顯示紅色的正號(hào)（+）,陰性結(jié)果則為負(fù)號(hào)（），目視判斷直觀、明了。免疫層析實(shí)驗(yàn)免疫層析實(shí)驗(yàn)（ICA）

14、是繼IFA之后反站起來的另一種膜固相免疫測(cè)定。與IFA利用微孔膜的過濾性能不同，ICA中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)， 猶如層析一般。移動(dòng)過程中被分析物與固定于膜上某一區(qū)域的抗原或抗體結(jié)合而被固相化， 無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標(biāo)記物的顯色來判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以膠體金為標(biāo) 記物的實(shí)驗(yàn)稱為金免疫層析實(shí)驗(yàn)（GICA）。ICA中所用的試劑全部為干試劑，它們被組合在一試劑條上。試劑條的底版為一單面膠塑料片，A、B兩端粘貼有吸水材料。加樣端 A為樣品墊，可用的材料有濾紙、多孔聚乙烯和玻璃纖維等，按分析物和試劑的不同選擇合適的材料。B端為吸水墊，材料則為吸水性強(qiáng)的濾紙為佳。G

15、處為結(jié)合物墊，膠體金結(jié)合物干燥固定在玻璃纖維膜等材料上。G、B之間粘貼吸附有抗原或抗體的硝酸纖維素膜，抗原或抗體往往以直線的形式包被在膜上。一雙抗體夾心法測(cè) HCG為例。試條中G處為金標(biāo)記的抗a HCG , NC膜上T處包被抗3 HCG , C處包被抗小鼠IgG抗體。測(cè)試時(shí)在A端加尿液（或 將A端浸入尿液中），通過層析做HCG-HCG復(fù)合物；移行至T區(qū)，形成金-抗a -HCG-HCG- 抗3 HCG復(fù)合物，在 T區(qū)顯示紅色線條，為陽性反應(yīng)。多余的金標(biāo)記抗aHCG移行至C區(qū)時(shí)被抗小鼠IgG抗體捕獲，而顯示出紅色對(duì)照線條。如尿液中不含HCG,在T區(qū)不出現(xiàn)紅色線條，僅在 C區(qū)出現(xiàn)紅色線條，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為

16、陰性。如C區(qū)無紅色線條出現(xiàn)，表示實(shí)驗(yàn)無效。雙抗體夾心法加底物顯色。固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過比色，測(cè)標(biāo)本中抗原的量。雙位點(diǎn)一步法 操作步驟將1個(gè)McAb與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相McAb。洗滌除去未結(jié)合物。同時(shí)加入待測(cè)標(biāo)本和酶標(biāo) McAb,孵育，使待檢抗原和固相 McAb及酶標(biāo)McAb反應(yīng)形成 雙抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物。加底物顯色。 間接法 操作步驟 將已知抗原包被固相載體，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。 封閉：用高濃度無關(guān)蛋白封閉，阻止待檢血清中非特異 IgG吸附固相。加待檢血清，孵育，使固相抗原和待檢抗體充分結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的非特異抗體及 其他血清成分。加酶標(biāo)抗體或酶標(biāo) SPA,孵育，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗抗體（或酶標(biāo)SPA）復(fù)合 物。加底物顯色。 雙抗原夾心法 操作步驟 將已知抗原包被固相載體，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合物。加入待檢標(biāo)本