質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測

1、實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測一實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)掌握堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA二實(shí)驗(yàn)原理1 .細(xì)菌中有兩種DNA即染色體DNAF口質(zhì)粒DNA2 .質(zhì)粒DNA的提取方法有三種：堿裂解法，煮沸法，去污劑(如 Triton和 SDS裂解法。3 .堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細(xì)胞DNAS性，共價閉合環(huán)狀DNAi于空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當(dāng)外界條件到達(dá)復(fù)性條件時，質(zhì) 粒DNA勺雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，而較大的線性染色體DNA®以復(fù)性。三實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌(含有質(zhì)粒的大腸桿菌)四、實(shí)驗(yàn)用具和藥品1 .實(shí)驗(yàn)用具：搖床，離心機(jī)，移液器及槍頭，玻璃試管(15mD及塞子，離心管(

2、1.5mL)2 .實(shí)驗(yàn)試劑：(1)溶液I50 mmol/L葡萄糖25 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris ) Tris - HCl ( pH8.0)10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA (pH8.0)(2)溶液II0.4mol/L NaOH , 2%SDS用前等體積混合(3)溶液 III 5 mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水28.5ml(4) TE緩沖液10 mmol/L Tris - HCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)(5) 70%S醇(放-20C冰箱中，用后即放回)(6)加樣緩沖液(6X): 40姍糖、0.25%澳酚蘭(7)電泳緩沖液：

3、0.045mol/L Tris- 硼酸 0.001mol/L EDTA (0.5X TBE精品buffer )精品電泳緩沖液貯存液：5X: 54g Tris 堿、27.5g 硼酸、20ml 0.5mol/L EDTApH8.0）五實(shí)驗(yàn)步驟（一）細(xì)菌繁殖挑取白色的單菌落若干，轉(zhuǎn)移到3mL液體LB培養(yǎng)基（附加100mg/mlAmp ）,37 C過夜振蕩（200r/min ） 培養(yǎng)0（二）菌體收集將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，離心30sec 5000r/min ；棄上清提取質(zhì)粒 （三）質(zhì)粒提取方法一：堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA1 .將上述沉淀重懸于250仙L冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈震蕩；2 .加

4、入250仙1溶液11,蓋緊管口，快速顛倒離心管 510次；3 .加入350 pL冰預(yù)冷的溶液田，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管510次；9000r/min 離心5min上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；4 .加等體積氯仿，振蕩混合，靜置，9000r/min離心5min,上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；5 .加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉和2倍體積的乙醇，充分混勻，靜置 5min； 9000r/min 離心 5min；6 .棄上清，用70% ethanol洗滌；7 .力口 30仙LTE溶解，-20 C保存。方法二：試劑盒提取方法1 .離心收集的菌體中加入含 RNAase的溶液I 250仙

5、L,重懸菌體，不應(yīng)留有小的 菌塊；2 .加溶液11 250 H L,輕輕顛傕J離心管4-6次，使菌體充分裂解，至溶液澄清；3 .加入350 pL冰預(yù)冷的溶液加，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次；4 . 12000r/min 離心 10min；5 .將上清轉(zhuǎn)移到 DNAg合管（置于2 ml離心管中），12000r/min離心1min, 棄濾液；6 .將制備管置回離心管，加入去蛋白試劑 500仙L, 12000r/min離心1min,棄 濾液精品7 .將制備管置回離心管，加洗滌液 700 L, 12000r/min離心1min,棄濾液； 以同樣的方法再用700洗滌液洗滌一次，棄濾液。8 .將制備管置回2 ml離心管中，12,000 xg離心1 min ,去除殘余的洗滌液； 10將DNA吉合柱放入另一個新的1.5mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 洗脫液或去離子水，室溫靜置 1 min o 12,000 Xg離心1 min。（四）檢測提取DNA&量的電泳檢測。取4ul質(zhì)粒DNA+2ul力口樣緩沖液+6ul ddH2O;配制1%勺瓊脂糖凝膠電泳30min, EB染色，拍照。注意事項(xiàng)：氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可 損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手