DNA重組DNArecombination技術(shù)：外源基因的蛋白表達(dá)-4

1、DNAt組(DNA recombination )技術(shù)：外源基因的蛋 白表達(dá)-4(3) CHOffl胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)：動物細(xì)胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)中外源基因沒有穩(wěn)定地整合到 宿主細(xì)胞染色體中,一染色體外DNA勺形式存在.因而只能瞬時表達(dá).要使外源基 因在宿主細(xì)胞中高效、穩(wěn)定地表達(dá),必須建立一個穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng),包括適宜的表達(dá) 載體、有效的基因轉(zhuǎn)染、標(biāo)記基因和目標(biāo)基因的選擇與共擴(kuò)增、受體適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì) 胞和培養(yǎng)條件.現(xiàn)以pMT加載體,二氫葉酸復(fù)原酶(DHFR未標(biāo)記基因,CHCffl胞 為受體細(xì)胞,介紹哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng).pMT左哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中和瞬時表達(dá)系統(tǒng)中有所不同,區(qū)別在此表達(dá)載 體中含有鼠

2、的DHF基因序列,作為選擇標(biāo)記基因,并在動物細(xì)胞內(nèi)可進(jìn)行擴(kuò)增.pMT2表達(dá)載體既可在瞬時表達(dá)系統(tǒng)中起作用,又可在穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)外源基 因.選擇性標(biāo)記基因的作用就是為帶有外源基因的哺乳動物細(xì)胞提供選擇標(biāo)記.作為選 擇性標(biāo)記基因必須和目的基因一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并在細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,然后作為標(biāo)記 獲得含有目的基因的細(xì)胞.DHF時目前應(yīng)用得比擬廣泛的選擇性標(biāo)記基因. DHF的 作用指催化二氫葉酸復(fù)原成四氫葉酸.當(dāng)葉酸的類似物氨基喋吟和氨甲喋吟( meth otrexate,MTX )存在時,可與葉酸競爭結(jié)合 DHFRW制DHF的活性,使細(xì)胞死亡. 當(dāng)細(xì)胞中DHF塞因大量擴(kuò)增,并有高表達(dá)時,MTXP足

3、以競爭2合全部的DHFR使 細(xì)胞在含有MTX勺培養(yǎng)基中可存活.利用這一特點,和外源基因共同擴(kuò)增的DHFIE因可利用它對MTX勺抗性,篩選出含目的基因的細(xì)胞.一般選用DHF塞因缺陷的CH削胞,便于篩選目的基因.CHOffl胞適用于多種蛋白質(zhì) 的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)；有對培養(yǎng)基的適應(yīng)性強(qiáng)的特點；可進(jìn)行大量的培養(yǎng),大規(guī) 模生產(chǎn).外源基因的轉(zhuǎn)染方法可選用磷酸鈣共沉淀方法、聚乙二醇介導(dǎo)的細(xì)胞融合法以及電 穿孔導(dǎo)入法等.要想得到長久穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系,必須對轉(zhuǎn)入的目的基因及可擴(kuò)增 的選擇性標(biāo)記基因通過增加選擇物的濃度(DHF基因通過增加MT澈度),使外源 基因進(jìn)行擴(kuò)增,并穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞的染色體上.當(dāng)細(xì)胞

4、在沒有選擇物的情況 下,得到擴(kuò)增的基因可以穩(wěn)定存在下去.三、表達(dá)產(chǎn)物的別離、純化與鑒定(一)大腸桿菌重組表達(dá)蛋白的別離、純化大腸桿菌的分泌型蛋白和融合型蛋白的純化有所不同,分泌型表達(dá)蛋白的純化必須 通過細(xì)胞的溶解、包涵體的別離、變性和折疊復(fù)性等步驟；而融合型表達(dá)蛋白除了 以上個步驟外,由于是融合蛋白,所以必須在包涵體別離、變性以后在進(jìn)行定點裂 解以釋放重組的多肽并折疊復(fù)性.1 .大腸桿菌重組表達(dá)蛋白質(zhì)別離的粗制品一般步驟包括：離心收集菌體-超聲波破碎-離心收集上清-熱處理變性-離心 上清用硫酸錢沉淀.大腸桿菌經(jīng)過離心濃縮以后可用機(jī)械磨碎法、超聲波處理法或溶菌酶加去污劑法將 包涵體別離.在大腸桿

5、菌表達(dá)產(chǎn)率過高,超出大腸桿菌的代謝水平時,表達(dá)產(chǎn)物累 積起來,高濃度導(dǎo)致形成多聚體,然后形成包涵體.包涵體的形成和溶液pHfi和蛋白質(zhì)本身的溶解度有關(guān)；和蛋白質(zhì)之間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用有關(guān)； 和高溫培養(yǎng)條件有關(guān).包涵體是蛋白質(zhì)的聚合體,包含了表達(dá)的目的基因產(chǎn)物、大 腸桿菌菌體蛋白成分、質(zhì)粒編碼的蛋白、其他污染成分.溶解包涵體常用的變性劑 有尿素、鹽酸月瓜、SD第.一般的情況以超聲波處理方法為主.對于融合蛋白來說,除了對包涵體的處理以外,還必須使其重組蛋白從中釋放.由 于融合蛋白通?？梢缘玫礁咝П磉_(dá),且比擬穩(wěn)定,融合蛋白比多數(shù)菌體蛋白大,因 此電泳中易于鑒定.盡管融合蛋白可大量產(chǎn)生

6、,又易于純化,但在別離純化過程中 必須進(jìn)行定點裂解,以獲得感興趣的重組蛋白.定點裂解可用澳化氫裂解或蛋白酶 水解方法.重組蛋白的從包涵體中釋放是缺乏生物學(xué)活性的；一系列的純化過程中,處理的條 件比擬劇烈,使蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)破壞,因此重組蛋白的復(fù)性特別重要.蛋白質(zhì)復(fù)性 的原那么是恢復(fù)其高級結(jié)構(gòu),并使之穩(wěn)定,一般低濃度的尿素3mol/L尿素,可使變形的蛋白質(zhì)重新折疊.復(fù)性前提是蛋白質(zhì)必須到達(dá)一定的純度,另外還與蛋白質(zhì) 的濃度、溫度、pH®及氧化復(fù)原劑條件等密切相關(guān).2 .大腸桿菌重組表達(dá)蛋白質(zhì)別離的精制品大腸桿菌重組表達(dá)蛋白質(zhì)別離的粗制品要經(jīng)過凝膠層析、離子交換層析的純化,獲得相對的純品,

7、獲得的純品然后還需經(jīng)過活性、純度、和序列的測定加以確定.二酵母重組表達(dá)蛋白的別離、純化酵母重組表達(dá)蛋白的別離、純化分為兩種情況：酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)和蛋白分 泌型：1 .酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的別離純化酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的別離純化的過程比擬簡單,以a -蛋白酶抑制劑的 純化為例：收集酵母細(xì)胞-用玻璃珠破碎-離心取上清fDEAE Sepharos趙析柱 -用0-0.3mol/L NaCl梯度洗脫-收集活性局部,濃縮-SephadexG7層析-收集活 性局部,濃縮-SDSPAGE屯度鑒定達(dá)95犯上.2 .酵母表達(dá)分泌型重組蛋白的別離純化 以酵母表達(dá)干擾素純化為例：發(fā)酵液用0.45 N

8、 ml徑的Milipore濾膜過濾濃縮-DEAETrisacryl層析柱用0-0.3mol/L NaCl梯度洗脫收集干擾素局部fSephadexG751膠過濾 用50mmol/Limidazole , pH6.8洗脫收集干擾素-用水稀釋1倍層析聚焦Ph armacia,PBE94緩沖液洗脫-干擾素電泳鑒定,純度大于 95% N-末端序列正確, 二硫鍵結(jié)構(gòu)和天然一致,總回收率為13%提升酵母表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白的產(chǎn)量的方法是解聚技術(shù)：把聚合體變?yōu)閱误w的技術(shù),相當(dāng)于大腸桿菌的包涵體處理技術(shù).聚合體在變性的條件下4mmol/L尿素處理,凝膠過濾可得到較好的層析峰.SDS加熱也不失為一種解聚的方法.三CHO3胞的表達(dá)重組蛋白的純化、鑒定CHOB胞收集、離心-取上清,加 EDTA貯存與-20C-離子交換層析S-Sepheros e-收集洗脫NT-3-洗脫液用超濾方法濃縮-凝膠過濾Sephacryl S-100HR-收集層析峰含NT-3局部,并進(jìn)行濃縮 -上反相HPL偃析柱C18 -SDSPAGE 純度鑒定-HPLC!析峰中含NT-3局部進(jìn)行序列分析.四重組蛋白質(zhì)分析鑒定根本要求重組蛋白質(zhì)的鑒定方法一般可以通用,但要根據(jù)不同的蛋白質(zhì)選用其中局部進(jìn)行運(yùn)用： 重組蛋白質(zhì)的鑒定方法及標(biāo)準(zhǔn)檢查內(nèi)容 分子量 等電點 純度結(jié)構(gòu)分析生物學(xué)活性分析方法SDS-PAGE等電點聚焦電泳HPLCWestern