Caveolin－1基因mRNA和蛋白在胃癌組織的表達

1、Caveolin1基因mRNA和蛋白在胃癌組織的表達 作者：劉斌楊育生邢傳平高自芳顧立萍錢震董亮蘇勤軍 【摘要】 目的： 通過研究Caveolin1 mRNA及蛋白在胃不同病變組織中的表達, 對mRNA 及蛋白表達的相關(guān)性及與胃癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系進行分析. 方法： 25例正常胃黏膜、65例不典型增生胃黏膜及71例胃癌組織，采用免疫組化SP法檢測蛋白的表達情況；依據(jù)GenBank 中Caveolin1基因序列（NC000007），設(shè)計并合成全長21 bp的寡核苷酸探針，運用原位雜交技術(shù)對Caveolin1 mRNA 的表達進行檢測. 結(jié)果： Caveolin1 mRNA和蛋白在正常胃黏膜、不

2、典型增生胃黏膜及胃癌細胞胞漿中的陽性表達率呈遞減趨勢，陽性率分別為：92.0%, 83.1%, 38.2% 和 88.0%, 83.1%, 28.2%. Caveolin1 mRNA和蛋白表達在不同浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、有無脈管侵犯組內(nèi)表達率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在年齡及性別組內(nèi)表達率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05). Caveolin1 mRNA和蛋白表達呈正相關(guān)（rs=0.967, P<0.05）. 結(jié)論： Caveolin1 mRNA和蛋白在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜、胃癌中陽性表達率均逐漸降低，兩者在不同病變組織中表達的一致性提示該基因在癌組織

3、中的低表達發(fā)生于轉(zhuǎn)錄或以上水平的抑制. 【關(guān)鍵詞】 胃腫瘤； Caveolin1基因；免疫組織化學(xué)；原位雜交 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of Caveolin1 mRNA and protein in different lesions of gastric tissues and to analyze the correlations among mRNA, protein expression and clinical parameters. METHODS: SP immunohistochemical method an

4、d in situ hybridization (ISH) method were respectively used to detect the expression of Caveolin1 protein and mRNA in 25 normal gastric tissues, 65 gastric atypical hyperplasia cases and 71 gastric carcinoma cases. The 21 bp oligonucleotide probe of Caveolin1 gene sequence was designed and synthesiz

5、ed according to GenBank (NC000007). RESULTS: The positive expressions of Caveolin1 mRNA and protein in normal gastric tissues, gastric atypical hyperplasia and gastric carcinomas were gradually decreased and the positive rates were 92.0%, 83.1%, 38.2% and 88.0%, 83.1%, 28.2%, respectively. The expre

6、ssion of Caveolin1 mRNA and protein was correlated with the malignant progression of gastric carcinoma, lymph nodes metastasis and vessel invasion (P<0.05), but not correlated with patients age and gender (P>0.05). In addition, the expression of Caveolin1 mRNA was positively related to the pro

7、tein expression (rs=0.967, P<0.05). CONCLUSION: The positive rates of Caveolin1 mRNA and protein in normal gastric tissues, gastric atypical hyperplasia and gastric carcinomas are gradually decreased. The consistency of Caveolin1 mRNA and protein expression in different lesions shows that the sup

8、pressed expression of Caveolin1 gene in carcinoma tissues takes place at the transcription level or above. 【Keywords】 stomach neoplasms; Caveolin1 gene; immunohistochemistry; in situ hybridization 0引言 腫瘤發(fā)生過程中原癌基因和抑癌基因之間的關(guān)系以及抑癌基因的失活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生最重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ). 抑癌基因具有潛在抑癌作用（抑制細胞生長），在癌旁相應(yīng)的正常組織中正常表達，但在癌組織中往往表現(xiàn)為m

9、RNA 表達下降及蛋白產(chǎn)物缺失，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生1. Caveolin1是一種侯選抑癌基因，在結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤組織中低表達2-3，而在前列腺癌、膀胱癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌中高表達4-6. 本研究采用免疫組織化學(xué)SP法和原位雜交以及胃癌組織芯片技術(shù)觀察正常黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌組織中Caveolin1 mRNA及蛋白表達在不同病變胃組織中的表達定位、對mRNA及蛋白表達的相關(guān)性以及與胃癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系進行分析，從而探討Caveolin1基因的功能，研究Caveolin1在胃癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移中的作用，以期為胃癌的臨床診斷及預(yù)后提供一種新的生物學(xué)指標. 1材料和方法 1

10、.1材料 65例不典型增生胃黏膜及71例胃癌組織均來自蘭州軍區(qū)總醫(yī)院200408 /200507病理科手術(shù)及存檔石蠟包埋標本. 胃癌組包括男性49例，女性22例，年齡3084(中位年齡61)歲. 所有標本術(shù)前均未行放療和化療，胃癌組織包括高分化腺癌21例，中分化24例，低分化26例；其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性35例，有脈管侵犯者49例. 同時取距離腫瘤組織>5 cm的胃黏膜25例作為正常對照. 所有標本均經(jīng)40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 m厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色及原位雜交. Caveolin1抗體為鼠抗人單克隆抗體（稀釋度為1400）購于美國基因公司. 原位雜交檢測試劑盒(

11、REMBRANT Universal RISH & HRP Detection Kit)購于PanPath 公司. Caveolin1基因寡核苷酸探針：使用Oligo軟件設(shè)計探針，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成. Caveolin1寡核苷酸探針序列為5CTCAG CCAAT AAAGC GATGG A3，探針片段長度21 bp，3端標記地高辛. 1.2方法 1.2.1免疫組化SP法染色石蠟切片，烤干后脫蠟至水，高溫修復(fù)，30 mL/L H2O2孵育10 min,加入非免疫性動物血清孵育10 min，加入一抗過夜，再加入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片. Caveolin1

12、陽性表達均位于細胞質(zhì)內(nèi). 1.2.2原位雜交石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，30 mL/L H2O2室溫放置10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加3%鹽酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37消化15 min，以暴露mRNA核酸片斷，變性及雜交，過夜，加HRP化鼠抗地高辛，37孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片. mRNA表達：胞質(zhì)內(nèi)著棕黃色為Caveolin1 mRNA信號陽性. 1.2.3結(jié)果判定 采用雙盲法對每張切片在高倍鏡（400）下計數(shù)10個視野，以染色強度分別計03分，無染色為0分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再以陽性細胞所占百分比評分，陰性為0分，陽性細胞10%為1分，11%50

13、%為2分，51%75%為3分，75%為4分；兩項得分相乘，0分為“”，12分為“+”，68分為“”，912分為“”. 基因擴增：細胞核內(nèi)檢測到陽性信號（正常細胞核內(nèi)無陽性信號）即為基因擴增. 統(tǒng)計學(xué)處理： 組間率的比較采用2檢驗，測量指標間相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)，使用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理. P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1Caveolin1 mRNA和蛋白在不同病變的胃組織中的表達 Caveolin1 mRNA在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌細胞胞質(zhì)中的表達陽性表達率呈遞減趨勢（圖1），2檢驗顯示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=108.40

14、3, P<0.05）, Caveolin1 mRNA在部分癌細胞核中呈強陽性表達，蛋白陽性表達率在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌各組間呈遞減趨勢（2=36.328， P<0.05，圖2）. 另外，Caveolin1 mRNA在胃黏膜不典型增生組和胃癌組間陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=47.556， P<0.01）；胃黏膜不典型增生和高分化腺癌組間陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=4.980， P<0.05，表1). 表1不同胃黏膜組織中Caveolin1 mRNA和蛋白表達（略） 2.2Caveolin1基因mRNA和蛋白在胃癌中的表達Caveolin1基因mRNA和蛋白表

15、達在不同浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、有無脈管侵犯組內(nèi)表達率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在年齡及性別組內(nèi)表達率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05，表2). Spearman等級相關(guān)分析顯示Caveolin1 mRNA和蛋白表達呈正相關(guān)（rs=0.967, P<0.05）. 表2胃癌組織中Caveolin1 mRNA及蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（略） 2.3胃癌組織中Caveolin1基因擴增和細胞漿內(nèi)mRNA表達的相關(guān)性正常胃黏膜和不典型增生胃黏膜中細胞核內(nèi)均未見Caveolin1基因擴增，但部分胃癌組織中可見癌細胞核中有基因擴增，并且其表達趨勢與Caveolin1 蛋白和胞漿

16、內(nèi)mRNA表達呈相反趨勢（表3）.表3胃癌中Caveolin1蛋白表達、基因擴增和胞漿內(nèi)mRNA表達的相關(guān)性（略） 3討論 腫瘤組織中基因表達指從基因轉(zhuǎn)錄到產(chǎn)物最終發(fā)揮生物學(xué)功能的全過程，基因表達異常的最終表現(xiàn)是該基因生物學(xué)功能的喪失或增強，基因表達研究主要是檢測所表達蛋白和基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，二者具有如下關(guān)系： 蛋白質(zhì)表達正常，而功能喪失或異常，說明翻譯后修飾階段異?；蚴墙Y(jié)構(gòu)基因發(fā)生了突變； 蛋白質(zhì)表達明顯改變，需要進行基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（RNA）水平的分析； RNA降低，表明基因表達在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制； RNA正常而蛋白水平改變，表明蛋白質(zhì)的翻譯過程受到影響. 目前，國內(nèi)外關(guān)于腫瘤組織中Cave

17、olinl基因的研究還尚少，而且對于其在不同腫瘤組織中表達的研究結(jié)果并不一致7-10（甚至在同一種腫瘤組織中的表達結(jié)果也不盡相同），人們對于Caveolinl基因的認識還有待于進一步加深. 本研究通過對正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌中Caveolin1蛋白和mRNA表達率的統(tǒng)計分析，顯示Caveolin1在正常胃黏膜不典型增生胃黏膜胃癌中陽性表達率逐漸降低，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在胃癌不同的浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組內(nèi)差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 胃癌組織中Caveolin1蛋白表達明顯降低，同時，胃癌組織中mRNA表達降低，上述結(jié)果提示胃癌中Caveolin1基因表達在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制. 由此我

18、們確立胃癌中Caveolin1基因表達降低的研究方向主要包括DNA點突變、染色體移位、大片段DNA缺失、基因擴增、堿基的異常修飾等. 研究中還發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜和不典型增生胃黏膜中細胞核內(nèi)均未見陽性信號表達，說明了此類病變未出現(xiàn)核內(nèi)異常基因擴增，但胃癌組織中可見細胞核陽性信號表達，并且其表達趨勢與Caveolin1蛋白和胞漿內(nèi)mRNA表達呈相反趨勢. 從另外一個角度佐證了胃癌中Caveolin1基因表達在轉(zhuǎn)錄水平受到抑制的觀點. 我們的研究結(jié)果與高雪等3在蛋白水平的研究結(jié)果基本一致即Caveolin1在胃上皮細胞中的表達水平隨著胃癌的發(fā)生和發(fā)展而呈進行性下調(diào)乃至缺失. 而在RNA水平的研究結(jié)果存在

19、差異：原位雜交結(jié)果顯示，Caveolin1 mRNA在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌細胞胞漿中的陽性表達率呈遞減趨勢；而高雪等3用RTPCR方法顯示，胃癌組織和相應(yīng)非癌胃黏膜組織中Caveolin1的表達無顯著性差異. 在重度不典型增生組和高分化腺癌組之間Caveolin1基因表達的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在胃黏膜癌前病變向胃癌的轉(zhuǎn)變過程中有可能存在著另外的調(diào)節(jié)因子或機制. 本研究中運用地高辛標記的寡聚核苷酸探針檢測Caveolin1基因mRNA表達，陽性率略高于其蛋白的表達. 寡聚核苷酸探針檢測技術(shù)具有敏感性高、背景清晰等優(yōu)點，但原位雜交技術(shù)實驗條件要求高，費用昂貴，不宜推廣. 【參

20、考文獻】 1查良德，藥立波. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2003:152-153. 2Davidson B, Goldberg I, GivantHorwitz V, et al. Caveolin1 expression in ovarian carcinoma is MDR1 independentJ. Am J Clin Pathol, 2002,117(2):225-234. 3高雪，孫媛，黃磊，等. Caveolin1在胃癌組織中的表達及臨床生物學(xué)意義J. 癌癥，2005, 24（3）:311-316. 4Kato K, Hida Y, Miyamoto M, et

21、al. Overexpression of caveolin1 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis and pathologic stageJ. Cancer, 2002, 94(4): 929-933. 5Savage K, Lambros MB, Robertson D, et al. Caveolin 1 is overexpressed and amplified in a subset of basallike and metaplastic breast carcinomas: a morphologic, ultrastructural, immunohistochemical, and in situ hybridization analysisJ. Clin Cancer Res, 2007, 13(1): 90-101. 6Suzuoki M, Miyamoto M, Kato K, et al. Impact of caveolin1 expre