白介素12抑制乙肝病毒在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)復(fù)制

1、白介素12抑制乙肝病毒在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的復(fù)制摘要：白細胞介素12（IL-12）是一種由抗原遞呈細胞產(chǎn)生的異源二聚體細胞因子，它能夠強有力的誘導T細胞和自然殺傷性細胞（NK）分泌干擾素-gamma（IFN-），并能夠啟動Th1型免疫應(yīng)答。這些性質(zhì)提示IL-12在抗病毒免疫反應(yīng)，包括抗乙肝病毒反應(yīng)中起著重要作用。最近，通過對HBV轉(zhuǎn)基因鼠的研究發(fā)現(xiàn)，重組IL-12能夠在肝組織誘導產(chǎn)生由IFN-介導的HBV特異性細胞毒反應(yīng)，啟動不伴有細胞壞死的抗HBV免疫反應(yīng)。研究還證實重組鼠源白介素12的抗病毒作用在肝外器官，例如感染的腎組織同樣有效。DNA斑跡法證明重組白介素12能夠在不發(fā)生或只發(fā)生輕微炎癥的劑

2、量下促使HBV復(fù)制中間產(chǎn)物從肝腎組織中完全消失，說明重組白介素12對肝和肝外的HBV病毒復(fù)制有較強的抑制作用。免疫組織化學分析重組白介素12不但能夠阻止乙肝病毒裝配，還能夠啟動病毒復(fù)制顆粒的降解。更為重要的是，研究證實重組白介素能夠在治療后的肝腎組織誘導產(chǎn)生IFN-, 腫瘤壞死因子（TNF-）和IFN-/ mRNA，其抗病毒作用主要是由IFN-所介導的。這些研究結(jié)果表明，重組白介素12通過在肝臟及肝外器官誘導產(chǎn)生IFN-，啟動不伴有細胞壞死的抗HBV免疫反應(yīng)，從而抑制或清除這些器官中的HBV病毒，預(yù)示著重組白介素12在治療慢性HBV感染方面具有重要價值。在HBV感染過程中， 病毒抗原特異性細胞

3、免疫反應(yīng)對根除病毒起著重要作用。急性HBV感染者之所以能夠徹底清除病毒，是因為體內(nèi)同時啟動強大的、多克隆的、多特異性的Th1和Th2免疫反應(yīng)。相反，慢性HBV感染者不能啟動全面而強有力的T細胞免疫應(yīng)答，導致病毒無法自行清除。先前研究證實HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）能夠在HBV轉(zhuǎn)基因的小鼠肝臟中引起壞死性炎癥。而近期的研究發(fā)現(xiàn)由IFN-， TNF-介導的細胞毒性反應(yīng)能夠有效地抑制肝內(nèi)病毒基因表達和復(fù)制。這些研究結(jié)果提示CTL抗病毒免疫應(yīng)答過程中的主要細胞因子通過影響CTL對感染的肝細胞的殺傷程度或者直接抑制病毒復(fù)制來減輕感染。IL-12是由抗原遞呈細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子，對調(diào)節(jié)Th

4、1 CD4+T細胞和CD8+ CTL分化有重要作用。許多研究還證實IL-12在抗病毒、細菌、寄生蟲、霉菌感染等起到重要的作用，它的免疫效應(yīng)主要是誘導產(chǎn)生大量內(nèi)源性IFN-。野生型非IFN-受體基因敲除的小鼠在給予鼠源IL-12后可以避免腦炎心肌炎病毒引起的致命感染。同樣，外源性IL-12可以保護正常小鼠避免鼠白血病病毒感染引起的免疫功能缺陷，而對于IFN-抵抗或是IFN-基因敲除的小鼠則不起作用。以上的研究結(jié)果表明，IL-12對清除細胞內(nèi)病毒有重要作用，但是IL-12究竟是通過增強Th1型細胞免疫應(yīng)答來清除病毒，還是通過誘導T細胞產(chǎn)生細胞因子直接起抗病毒作用尚未闡明。最近有研究證明HBV特異性

5、CTL所產(chǎn)生的Th1型細胞因子能夠抑制或清除病毒基因在HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝內(nèi)的表達和復(fù)制。本實驗中將闡明為什么在缺少特異性免疫應(yīng)答的時候IL-12仍然可以發(fā)揮相同的抗病毒作用。 材料和方法 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠：譜系1.3.46（官方指定T Tg HBV 1.3 genome Chi46)。這些動物通過顯微注射(法)，將HBV病毒DNA末端植入近親小鼠B10.D2的胚胎。在這些轉(zhuǎn)基因小鼠的肝實質(zhì)細胞和腎臟近曲小管可以觀察到HBV高度復(fù)制，不伴有細胞病理學損害。譜系1.3.46通過重復(fù)的與B10.D2 逆代雜交，然后其中一代與BALB/c小鼠逆代雜交獲得F1雜交品系，用于本實驗，年齡（6-10周），性

6、別（雄），血清的乙型肝炎表面抗原表達水平是相同。白介素12： 重組鼠源IL-12由Maurice Gately(Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.).惠贈。每組3-4只轉(zhuǎn)基因鼠于1、3、5、714天腹腔連續(xù)注射重組IL-12，劑量從1ng/300ul到1ug/300ul，用含有1%1.3.46和BALB/c小鼠第一代雜交鼠血清的生理鹽水稀釋IL-12，對照組只有含1%血清的生理鹽水。最后一次注射IL-12 16h后將動物處死，將肝臟和脾臟收集用于實驗分析。尸檢取組織標本進行組織學病理學研究，其余放入液氮或-80攝氏度用于DNA和RNA分析。HBV DNA 分析，冰凍

7、的肝腎機械磨碎，常規(guī)分離DNA。通過DNA斑跡法對30ug HindIII消化的DNA進行分析，了解HBV復(fù)制水平。在電泳前，所有DNA 樣本都在37攝氏度下用10 ug/ml RNA酶水解1h。尼龍濾器(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, Ill.) 與含有32P放射標記的HBV特異性DNA探針相混合。在譜系1.3.46 轉(zhuǎn)基因是染色體組中單一位點的改變，它不包括HindIII的限制性內(nèi)切酶位點，用這種酶水解能產(chǎn)生單一緩慢的遷移條帶，與膜相連用于使用來量化分析和薄膜結(jié)合的DNA總量。復(fù)制型HBV DNA遷移成寬闊的條帶，分別生成1.6kbp單

8、鏈線性，3.2kbp雙鏈線形的, 和3.5kbp不規(guī)則環(huán)狀條帶。血清HBV DNA 分析 血清HBV DNA的定量是通過斑點印記法，收集400ml使用同樣處理方式的同組動物血清。年齡和性別相同的注射了生理鹽水的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠 的混合血清作為陽性對照，而非轉(zhuǎn)基因的B10.D2 3 BALB/c小鼠的混合血清為陰性對照。RNA分析法 RNA 印跡分析法 冰凍的組織通過機械磨碎，整條RNA由酸性胍酶異硫氰酸酚鹽三氯甲烷防腐藥 萃取，取RNA（20mg）分析HBV三磷酸甘油醛脫氫酶，2，5-腺嘌呤核苷酸合成酶表達。核糖核酸酶保護測定 利用一組線形的亞克隆作為模板，在T7聚合酶指導下定向合成32P標記

9、的反義RNA探針。免疫組織化學分析方法 胞內(nèi)乙型肝炎核心抗原的分布由通過生物素標記示蹤法檢測。一抗是兔抗HbcAg免疫血清，二抗是羊生物素抗兔免疫球蛋白。抗生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物、3-氨基-9乙基咔唑作為染色底物。疾病的生化和組織分析方法 檢測肝細胞損傷通過測量在注射IL-12后的幾個時間點的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。肝腎樣本被保存于含10%緩沖液的福爾馬林中，石蠟油包埋，切成厚度 3 mm的切片，用蘇木精和伊紅染色。抗細胞因子抗體 在注射第一次注射IL-12前6小時腹膜內(nèi)注射抗細胞因子單克隆抗體。倉鼠單克隆抗體 H22用于檢測Mifn-，倉鼠單克隆抗體TN3 19 用于檢測mTNF-a，羊中

10、和性免疫球蛋白用于檢測mIFN-/。純化的倉鼠免疫球蛋白G和正常的羊免疫球蛋白G都用做對照。結(jié)果IL-12抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝腎的HBV復(fù)制。 為證實IL-12抑制HBV復(fù)制的作用，轉(zhuǎn)基因小鼠治療時所用重組鼠IL-12劑量曾在其他感染各種病毒的鼠類模型上進行過試驗，發(fā)現(xiàn)這個劑量(3, 12, 3234)可用于提高抗各種病毒感染的能力的。在預(yù)實驗中，將年齡，性別和血清乙型肝炎表面抗原都相同的動物分成三組，腹膜內(nèi)每天注射1, 10, or 100 ng 的 IL-12，連續(xù)注射三天，它們的肝在最后一次注射16小時后被采集做DNA 印跡分析。這些結(jié)果與來自注射了鹽稀釋液的對照組相比。從圖1可以看到

11、抗病毒效應(yīng)呈明顯的劑量依賴性，當劑量為100ng/天，連續(xù)注射三天后可以看到HBV病毒復(fù)制中間產(chǎn)物幾乎全部消失。高劑量時，HBV DNA復(fù)制明顯被抑制，接著每天注射，連續(xù)5到14天，注射劑量增至1ug/ml時，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制基本停止，動物血清中的HBV DNA 同樣消失，這說明IL-12對病毒血癥同樣有效。這些結(jié)果表明IL-12同時抑制病毒復(fù)制和病毒血癥的有效劑量為100ng/天，連續(xù)三天。值得注意的是IL-12的抗病毒作用和sALT呈劑量依賴，這說明IL-12能引起這些動物肝臟出現(xiàn)輕微的壞死性炎癥。以往研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-12治療后的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)CTL的抗病毒作用，HBV RNA的消失是有轉(zhuǎn)錄后

12、調(diào)控機制來控制的。因此本研究中抽提上述動物肝臟中的RNA，通過RNA印跡法來評估。結(jié)果顯示，即使使用最高劑量的IL-12，1ug/天，連續(xù)注射14天，3.5kb 的前基因組RNA 和2.1kb的信使RNA仍大量在肝臟中復(fù)制。本研究的轉(zhuǎn)基因小鼠的HBV 病毒復(fù)制不僅在肝還在腎臟中高度表達。使用DNA 印跡法分析IL-12是否能夠抑制肝外組織中HBV的復(fù)制，分離同組轉(zhuǎn)基因鼠腎臟中的DNA，如圖2 所示，經(jīng)IL-12治療的小鼠腎臟中的DNA復(fù)制完全消失，盡管抑制腎臟中的病毒復(fù)制中間產(chǎn)物所需要的IL-12劑量要比肝臟高一些，排除這些微小的組織差異性，可以認為IL-12在肝外組織如腎臟，同樣有抗病毒作用

13、，但是和在肝臟中所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一樣，IL-12對腎臟中的HBV基因的表達沒有抑制效果。IL-12在肝和腎的細胞病變效應(yīng)。 因為IL-12在高劑量使用時有肝毒性，所以在尸解時，通過檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性了解IL-12是否導致肝損害（見圖1和2）。在使用IL-12的最小有效劑量時(100 ng /天，連續(xù)使用3 天)，在尸解時發(fā)現(xiàn)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性比正常(25 to 50U/liter)略升高(105 U/liter)，證明了HBV復(fù)制產(chǎn)物的消失不是因為IL-12對肝細胞的破壞。當使用IL-12最高劑量(1 ug)，連續(xù)使用5或更多天后，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性明顯升高 (5天為290 U/lite

14、r，14天為 483 U/liter)。然而，這樣的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的升高水平和先前在相同鼠系檢測到的CTL介導的肝肝損傷中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性相比還是非常低的。例如，同系的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在輸入107 HBV-特異性CTL后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(2800 U/liter)，一般認為只有一小部分肝臟受損。而使用IL-121ug/天，維持14天，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性(490 U/liter)，還不到CTL損傷的五分之一。由于IL-12是致炎細胞因子，為查找IL-12的致炎癥組織學依據(jù)，在最后一次注射IL-12 16小時后檢測肝和腎的組織切片。只有IL-12最高劑量（1ug/天）,連續(xù)使用5天或更多

15、天的的小鼠臟器中才能發(fā)現(xiàn)，肝實質(zhì)單核淋巴細胞及少量分散的壞死或退化的細胞浸潤。100ng/天或者1ug/天IL-12，連續(xù)使用三天后的動物的組織學檢測無異常（無數(shù)據(jù)顯示）。這些結(jié)果和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的水平相一致。這些數(shù)據(jù)顯示在足夠抑制HBV復(fù)制的劑量下，IL-12不會導致肝臟組織學病變。更只能膏藥的是。更為重要的是，如果使用劑量略高于IL-12的最小有效劑量 (100 ng/天 ，連續(xù)使用3 days)，在抑制HBV復(fù)制方面幾乎沒有作用（見圖2），卻能夠誘導肝毒性。腎組織切片組織學分析顯示，連續(xù)7天或更長的接受1ug的IL-12給藥的小鼠，其體內(nèi)呈現(xiàn)包括浸潤性單核細胞在內(nèi)的輕度間質(zhì)性腎炎（圖3F

16、）。連續(xù)5天接受1ug的IL-12的小鼠，其腎臟中幾乎無HBV復(fù)制中間體生成（圖2），組織學檢查也未發(fā)現(xiàn)任何腎臟疾?。〝?shù)據(jù)未顯示），表明腎臟內(nèi)HBV DNA 復(fù)制型消失。正如肝臟一樣，這并不是由組織損壞引起的。已接受IL-12治療的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)和腎臟內(nèi)細胞質(zhì)HBcAg的消失肝細胞小葉中心細胞和邊緣腎臟管型上皮細胞的細胞質(zhì)中的病毒核衣殼顆粒內(nèi)出現(xiàn)HBV DNA復(fù)制，通過免疫組織化學檢測為HBcAg（21）（圖3A和D）。大多數(shù)細胞核中也出現(xiàn)核殼體顆粒，但是這寫核內(nèi)核殼體顆粒是中空的（21）。IL-12給藥后，腎臟（圖3E）和肝臟（圖3B）中的細胞質(zhì)HBcAg均消失，并伴有HBV復(fù)制的消失（如

17、圖2）。這種關(guān)聯(lián)在所有IL-12的給藥劑量中都有所體現(xiàn)，表明這兩件事緊密相關(guān)。與缺乏IL-12抑制HBV DNA表達相符（圖2），盡管如此，IL-12給藥后，肝臟和腎臟內(nèi)的核HBcAg并未發(fā)生變化（圖3），表明IL-12不能作用病毒mRNA的翻譯。使用IL-12誘導細胞因子基因表達由于IL-12可誘導幾種細胞因子，特別是IFN-（如參考資料39），我們檢測了同等組織中細胞因子mRNA表達，如圖1-3所示。如圖4所示，用RNase蛋白分析TNF-和IFN-的表達水平，并用RNA印記技術(shù)分析IFN-/誘導的標志物25-OAS的表達。使用劑量低于100ng IL-12的小鼠，細胞因子表達很少或沒有（

18、數(shù)據(jù)未顯示）。接受每天一次、連續(xù)三天100ng IL-12給藥的小鼠，其體內(nèi)HBV復(fù)制得到有效抑制，housekeeping基因產(chǎn)品轉(zhuǎn)錄可誘導肝臟和腎臟內(nèi)細胞質(zhì)HBcAg表達、病毒血癥TNF-和25-OAS轉(zhuǎn)錄。在更高劑量的試驗組中，TNF-mRNA的表達得到進一步誘導，INF-水平可測，這或反應(yīng)了單核細胞和淋巴細胞等炎癥細胞的再生和激活，從而導致這些再生免疫細胞中其他細胞因子的生成。與上文結(jié)果相符，IL-12給藥后，我們觀察到小鼠肝臟和腎臟中mRNA 編碼CD3、CD4、CD8T細胞標志物的產(chǎn)生都呈劑量依賴性。IL-12給藥劑量低于100ng的試驗組中，未觀察到表明25-OAS具有表達性的I

19、FN-/生成（數(shù)據(jù)未顯示）；盡管如此，高劑量組中可觀察到低水平的IFN-/生成（圖4）?？偟膩碚f，這些結(jié)果證明，在給藥劑量不足以引起炎癥或炎癥輕微的情況下，IL-12給藥可誘導轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟和腎臟組織中TNF-a, IFN-, and IFN-/ mRNA的表達。 IL-12通過介導IFN-的生成可抑制HBV復(fù)制據(jù)估計，IL-12處理過的小鼠體內(nèi)細胞因子mRNAs的誘導可導致這些蛋白質(zhì)數(shù)量的增多。為了測定IFNs和TNF-在IL-12介導抑制這些動物體內(nèi)的HBV復(fù)制時所起作用，我們監(jiān)測了這些此包因子的中性特異性抗體的能力，以調(diào)節(jié)IL-12功效。每個實驗組小鼠的年齡、性別、血清HBsAg都相同，

20、分別接受腹膜內(nèi)注射鼠類TNF-特異性抗體、鼠類IFN-特異性抗體、鼠類IFN-/特異性抗體和對照抗體。所有小鼠均在使用抗體6小時后接受IL-12給藥(每天一次100ng, 連續(xù)三天)。末次注射16小時后，取出小鼠肝臟，分離出所有的肝性DNA，并用DNA印記技術(shù)分析(圖5)。IFN-特異性MAb的使用完全阻止了IL-12抑制肝性HBV復(fù)制的能力，同時也阻止了同一肝臟肝細胞中IL-12誘導的細胞質(zhì)HBcAg清除（數(shù)據(jù)未顯示），還抑制了血清中循環(huán)病毒的清除(圖5)。相反，TNF-或IFN-/抗體的有效率明顯偏低，僅能阻止IL-12發(fā)揮功效。 討論：如前所述，乙肝病毒特異性的細胞毒性T淋巴細胞經(jīng)抗原識

21、別后，分泌干擾素和腫瘤壞死因子，能夠以非溶細胞的方式清除HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的乙肝病毒基因表達和復(fù)制。我們同時發(fā)現(xiàn)，當這些動物受到淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染期間，肝內(nèi)巨噬細胞分泌/干擾素和腫瘤壞死因子，使得肝內(nèi)的乙型肝炎病毒的復(fù)制，也能明顯的被這種非溶細胞方式所抑制。 目前的研究表明，白細胞介素12在非細胞溶解的劑量內(nèi)，可使乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟和腎臟中乙肝病毒病毒核殼顆粒消失(Fig. 3)并中止病毒復(fù)制，從而清除血液中的病毒顆粒(Fig. 2)。我們還發(fā)現(xiàn)，白細胞介素12可誘導這些組織(Fig. 4)內(nèi)產(chǎn)生干擾素，/干擾素，腫瘤壞死因子，但白細胞介素12抗病毒的作用主要還是由-干擾素

22、所介導的(Fig. 5)。白細胞介素還可抑制了肝外乙肝病毒的復(fù)制，例如腎臟近端彎曲小管的上皮細胞(Fig. 2 and 3)。這個發(fā)現(xiàn)是十分重要的，因為這是第一次發(fā)現(xiàn)，除了肝臟以外，其他組織中的胞內(nèi)的乙肝病毒抗病毒也能被細胞因子給滅活。 白細胞介素12多種的免疫調(diào)節(jié)作用，包括它誘導-干擾素和其他炎癥細胞因子的能力，是眾所周知的。白細胞介素12的細胞毒性作用，尤其它能引起多數(shù)組織發(fā)生局部的單核淋巴炎癥反應(yīng)，包括肝臟和腎臟，這些都是已經(jīng)被描述過的。重要的是，在這份報告中描述的白細胞介素12的抗病毒活性不是由于它的細胞毒的潛能所達到的，因為此時并沒有發(fā)生任何肝臟或腎臟病變的情況，也增加這些組織炎癥細

23、胞的侵潤?？偟膩碚f，表明白細胞介素12只需通過周圍的固有的單核淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子，而不需要增加循環(huán)中炎癥細胞進入肝臟和腎臟組織，損傷組織中的實質(zhì)細胞，就能抑制乙肝病毒的復(fù)制。 為了確定由白細胞介素12在這些動物體內(nèi)先后誘發(fā)的作用，我們嘗試用中和抗體阻滯白介素12誘導的-干擾素，/-干擾素或腫瘤壞死因子的作用，來研究白細胞介素12的作用機制。使用抗-干擾素的抗體能減少白細胞介素12誘導的三種細胞因子，很大程度上暗示-干擾素誘導是白細胞介素12-激活的細胞因子級聯(lián)中最初始的活動。這是與報道一致的，-干擾素減少-腫瘤壞死因子在巨噬細胞中的基因表達。反過來說也是如此，據(jù)知-腫瘤壞死因子觸發(fā)自己的產(chǎn)物

24、和通過淋巴細胞和巨噬細胞釋放其他炎癥細胞因子的產(chǎn)物。根據(jù)這些結(jié)果，我們推測白細胞介素-12最初的作用是通過肝臟和腎臟固有自然殺傷細胞和T細胞誘導-干擾素生成。-干擾素可能激活巨噬細胞組織釋放更多的細胞因子，特別是腫瘤壞死因子和/-干擾素，這些能進一步增加局部細胞因子合成和-干擾素凝聚，從而抑制乙肝病毒在肝臟周邊和腎臟實質(zhì)細胞的復(fù)制。 需要提到的是，在其他試驗中，-干擾素，腫瘤壞死因子，/-干擾素通過使細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后的病毒RNA不穩(wěn)定，并加速其降解，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制和表達(13, 18, 19)。但在這次試驗中，它雖然能抑制乙肝病毒的復(fù)制，但任何劑量下(Fig.2)，白細胞介素-12并沒有表現(xiàn)出抑制肝臟或腎臟乙肝病毒mRNA的作用。目前還不清楚這種情況的原因，可能對細胞因子介導的抑制作用，乙肝病毒基因的自我復(fù)制比乙肝病毒基因表達更敏感，也可能是由于白細胞介素-12沒有誘導充足數(shù)量的或適當比例的細胞因子，以抑制治療動物的病毒基因表達。這個沒有解決的問題還需要進一