環(huán)境微生物綜合實驗報告2015

1、環(huán)境工程微生物學綜合性試驗報告環(huán)境水樣微生物學指標檢測學院：資源與環(huán)境學院專業(yè)：環(huán)境工程專業(yè)班級：環(huán)境131班組別：環(huán)境微生物實驗B組組員： 目錄前言3實驗目的和要求3采樣安排4醫(yī)學院采樣點分布圖4西安工業(yè)大學采樣點分布圖5醫(yī)學院采樣過程照片5西安工業(yè)大學采樣過程照片6采樣數據記錄表6材料方法6實驗所用主要儀器設備及試劑6儀器6培養(yǎng)基6實驗原理與步驟7實驗一7實驗二7實驗三8實驗四9實驗五9實驗六10結果與分析11采樣記錄11水樣總細菌群落測定11.大腸菌群檢驗初發(fā)酵結果的觀察14平板分離及革蘭氏染色結果記錄16平板分離得到的陽性菌落的相應特征記錄19復發(fā)酵結果的觀察和大腸菌群數目的MPN統(tǒng)計

2、20大腸菌群數目的MPN統(tǒng)計21參考文獻21使用教材及參考書21環(huán)境工程微生物學綜合性試驗報告綜合實驗環(huán)境水樣微生物學指標檢測前言  運用綜合應用微生物學基本原理和基本實驗技術，獨立完成培養(yǎng)基的制備與滅菌操作及不同類型微生物的分離、純化、觀察、描述，可初步進行鑒定、分類（此步不作要求）?？梢詾槲鬯?、垃圾等生物處理進行相關的實驗研究。實驗目的和要求自來水、河、池、湖水、純凈水中微生物學指標的檢測水樣來源：西安工業(yè)大學湖水和西安醫(yī)學院湖水1、基本內容l 學習水樣的采樣方法，采用平板菌落計數技術測定水中細菌總數；采用多管發(fā)酵法（MPN）測定水中大腸菌群。說明多管發(fā)酵法檢測水樣中大

3、腸菌群的原理和操作過程。l 記錄并報告實驗結果。l 結果分析與討論，經與國家標準比對檢查，水質狀況分析。2、基本要求l 全面掌握微生物實驗基本操作技能；l 掌握水中細菌總數測定方法；了解水質與細菌菌落之間的相關性；l 了解總大腸菌群數量指標在環(huán)境領域的重要性；l 掌握測定水中大腸菌群數量的多管發(fā)酵法。實驗操作    本實驗需要的基本操作訓練已經在前面的一些實驗中學習過，在這里不再一一列出每一操作步驟。為了幫助預習，將有關操作名稱列出，這些操作在建議參考書中都可以找到。1 培養(yǎng)基配制和滅菌2 無菌操作分離純化3 細菌染色和顯微鏡使用4 菌落特征觀察和描述5

4、 系列稀釋方法6  細菌鑒定指標測定采樣安排內容安排：水樣采集時間：11月27日上午（一部分組員采樣，一部分組員準備滅菌器具和配制培養(yǎng)基）步驟和注意事項：1. 按照樣品采集表（表1，見結果與分析）記錄樣點，編號，采樣時間，天氣，氣溫，水位，水質，現場監(jiān)測項目(pH)，采樣人姓名。并畫出采樣湖的平面圖，圖上標示出采樣點位置。醫(yī)學院采樣點分布圖西安工業(yè)大學采樣點分布圖2.容器應先用混合均勻的水樣充分洗滌23次，然后正式取樣；注意避免攪動沉積物而使水樣受污染；采集表層水樣時，應注意不能混入漂浮于水面上的物質。3. 采樣時的照片記錄醫(yī)學院采樣過程照片西安工業(yè)大學采樣過程照片采樣數據記錄表見結

5、果與分析材料方法實驗所用主要儀器設備及試劑儀器1 顯微鏡 2 革蘭氏染色用有關器材。3 高壓蒸汽滅菌器。4 干熱滅菌箱。5 恒溫箱。6 冰箱。7 放大鏡。8 試管、平皿（直徑9cm）、刻度吸管等，置于干熱滅菌箱中160滅菌2h。培養(yǎng)基1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液成分：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g 、氯化鈉5g、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml 蒸餾水1000ml2 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制3 伊紅美藍固體培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g 、乳糖10g 、磷酸氫二鉀2g 、瓊脂粉25g、蒸餾水1000ml 、2%伊紅水溶液20ml、 0.5 %美藍水溶液13ml 4 牛肉膏

6、蛋白胨固體培養(yǎng)基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸餾水1000ml、用1mol/LNaOH調pH至7.0、瓊脂粉20g 實驗原理與步驟實驗一內容安排：水樣采集時間：11月27日上午步驟和注意事項：1.按照樣品采集表（表1）記錄樣點，編號，采樣時間，天氣，氣溫，水位，水質，現場監(jiān)測項目(pH)，采樣人姓名。并畫出采樣湖的平面圖，圖上標示出采樣點位置2.容器應先用混合均勻的水樣充分洗滌23次，然后正式取樣；注意避免攪動沉積物而使水樣受污染；采集表層水樣時，應注意不能混入漂浮于水面上的物質。3.采樣時的照片記錄實驗二內容安排：水樣總菌落數測定及大腸菌群檢驗之初發(fā)酵實驗時間：11月

7、29日 9:00到12:00步驟和注意事項：一按照每組檢測兩個水樣準備要進行滅菌的玻璃器皿和試劑，包括：1.進行水樣總菌落數測定和大腸菌群檢驗初發(fā)酵實驗的試管、移液管和三角瓶等。試管18支（水樣總菌落數測定中稀釋6個梯度需5支，兩個水樣一共10支；大腸菌群檢驗初發(fā)酵實驗發(fā)酵管需4支，兩個水樣一共8支）；三角瓶2個（水樣總菌落數測定中初次稀釋需1個，兩個水樣共2個）；移液管10只（水樣總菌落數測定梯度稀釋需10ml一支，2ml的4支，兩個水樣共10支）；培養(yǎng)皿12個（水樣總菌落數測定共涂板3個梯度，每個梯度2個板子，共6個，兩個水樣共12個）；2.準備培養(yǎng)基：a.供大腸菌群檢驗之初發(fā)酵和復發(fā)酵實

8、驗的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每只試管5到10mL，一個水樣3管，兩個水樣共6管，加上復發(fā)酵需用的，至少準備120mL，可以一次配制300mL，供2組使用）；b.供大腸菌群檢驗之初發(fā)酵實驗的三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每只試管5到10mL，一個水樣1管，兩個水樣共2管至少準備20mL，一個班配制200mL<老師指定人員配制>，供全部小組使用）；c.供水樣總菌落數測定的蛋白胨固體培養(yǎng)基（每只培養(yǎng)皿25mL左右，12個培養(yǎng)皿300mL，每組至少配制300mL）3.發(fā)酵管的準備：將4支洗凈的杜氏小管裝入4個試管中，2個水樣共準備8支裝有杜氏小管的試管，然后在其中的6支中灌入普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

9、，2支灌入三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（注意，將大試管傾斜45度左右或更大角度，慢慢注入培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液在進入大試管的同時緩緩進入大試管中的杜氏小管中，并將杜氏小管中的空氣擠壓出去，若灌完培養(yǎng)液后仍有氣體存在，可以用指頭輕彈試管壁將之震出）；4.滅菌水的準備，每組至少準備500mL純凈水進行滅菌。二滅菌：1.將配制好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和分裝好普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管，以及剩下的未用完的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，還有之前準備好的各項玻璃器皿包裝好放入滅菌鍋進行高壓蒸汽滅菌。滅菌完畢后，一部分人進行水樣的梯度稀釋（注意，初次稀釋要進行大體積稀釋

10、，例如將20mL水樣加入180mL滅菌水中；每一步稀釋都必須保證將水樣混勻，特別是在進行試管稀釋時，切記）；同時，一部分組員進行牛肉膏蛋白胨平板的倒板工作（若選擇直接倒板法涂板的可不用進行此部分）；稀釋用的移液管要編號保存，后面涂LB平板的時候要對應吸取稀釋的水樣；2.大腸菌群檢驗初發(fā)酵管的接種：將10mL原始水樣加入到裝有三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，1mL原始水樣加入1支裝有普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中；稀釋10-1和10-2的水樣分別加入裝有普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液發(fā)酵管中將接種完畢的發(fā)酵管放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h到48h.3.水樣總菌落數測定之涂平板：從10-3到10-6稀釋梯度

11、中選擇3個梯度的稀釋水樣進行LB平板的涂板，方法可選用倒板法（在平板中加入1mL水樣后倒入20mL LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基溫度必須控制在40以下，倒板速度要快，防止倒板過程中LB固體培養(yǎng)基凝固）或涂板法（將1mL菌液加入到制好的LB平板上，再使用涂布器涂勻，涂布器每次使用前都要酒精燈干熱滅菌，冷卻后再涂板）；涂制好的平板放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h到48h。實驗三內容安排：水樣總菌落數測定及大腸菌群檢驗之初發(fā)酵實驗結果觀察和記錄時間：11月29日早上9:00到12:00（一部分組員進行實驗二的結果觀察和記錄，一部分組員進行實驗四的內容，先制作伊紅美藍培養(yǎng)基，清洗出計數后不用的培養(yǎng)皿（按照初發(fā)酵實驗結

12、果，有幾個陽性結果準備幾個培養(yǎng)皿）進行包裹滅菌，和制備好的伊紅美藍培養(yǎng)基一同滅菌）步驟和注意事項：1.水樣總菌落數測定結果的觀察（記錄到表2中）菌落計數：肉眼觀察，可用放大鏡，可標記；必要時分區(qū)計數，菌落成片者作廢。計算方法：a.某稀釋度的菌落數=兩平板菌落數取平均值。b.計數標準：選擇菌落數在30-300之間的稀釋度l 僅有一個稀釋度在此范圍：總菌落數=菌落數×稀釋倍數；l 有兩個稀釋度在30-300之間，兩梯度菌落數之比（兩個稀釋梯度涂板后所長的菌落數的比例）>2，選較小值作為菌落數進行計算，菌落數之比<2，取平均值；l 所有稀釋度均>300，取稀釋倍數最大者的

13、菌落數進行計算；l 所有稀釋度均<30，取稀釋倍數最小者的菌落數進行計算；l 沒有任何稀釋度在30-300之間，選最接近該范圍者；c.結果單位：CFU/mld.稀釋度選擇及細菌總數結果記錄2.大場菌群檢驗初發(fā)酵結果的觀察按照表3進行初發(fā)酵結果的記錄，產氣變色、產氣不變色、變色不產氣和不產氣不變色但變渾濁均為可疑陽性予以記錄，不產氣不變色也不渾濁為陰性記錄，產氣不變色不渾濁為操作失誤。實驗四內容安排：大腸菌群檢驗之平板分離實驗時間：11月30日19:30到21:00步驟和注意事項：1.伊紅美藍固體培養(yǎng)基的配制按照課本上的方式配制伊紅美藍固體培養(yǎng)基，按照初發(fā)酵實驗結果（有幾個陽性結果準備幾個

14、培養(yǎng)皿）準備所需培養(yǎng)基量（每個平板20-25mL）；2.滅菌將準備好的伊紅美藍培養(yǎng)基以及倒平板所需的培養(yǎng)皿（按照初發(fā)酵陽性結果數目進行準備）；3.倒板將滅菌好的伊紅美藍培養(yǎng)基倒入滅菌培養(yǎng)皿完成制板；4.涂板或劃線將初發(fā)酵實驗中陽性管中的菌液稀釋一定倍后(菌液渾濁度大的稀釋倍數適當放大）吸取1mL稀釋菌液進行涂板，或者直接使用接種環(huán)沾取初發(fā)酵陽性菌液進行平板劃線，劃線方式按圖1進行，劃線后的平板放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。實驗五內容安排：大腸菌群檢驗之平板分離實驗結果觀察、革蘭氏染色和復發(fā)酵實驗時間：12月2日10:00到12:00（一部分組員進行實驗四結果的觀察和記錄并進行革蘭氏染色，另一部分組

15、員進行復發(fā)酵實驗需用的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的準備<如果實驗二中剩下的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液沒有受污染則直接使用，準備復發(fā)酵管，并進行滅菌>，之后對滅菌后的復發(fā)酵管進行接種）步驟和注意事項：1.復發(fā)酵管的準備直接準備4個裝有杜氏小管的發(fā)酵管，按照實驗二的介紹加入實驗二時剩下的普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（每管5或10mL，若剩下的培養(yǎng)基已經受污染，則必須重新配制）。2.滅菌將步驟1中準備好的復發(fā)酵管進行滅菌。3.平板分離實驗結果觀察在滅菌等待過程中，進行平板分離實驗結果觀察，其中平板上的菌落若符合以下顏色特征則標記為陽性菌落。深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫

16、紅色，中心色較深的菌落。4. 革蘭氏染色挑取步驟3中的陽性菌落的一小部分進行革蘭氏染色（步驟如下），記錄結果。a用培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要??；b將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結晶紫溶液，1min后用水洗去；c滴加助色劑，1min后用水洗去；d滴加脫色劑，搖動玻片，直止無紫色脫落為止（約2030s），用水洗去；e滴加復染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。5.平板分離及革蘭氏染色結果記錄平板分離得到的陽性菌落的相應特征按照表4進行記錄，并補充革蘭氏染色結果。6.復發(fā)酵管的接種使用接種環(huán)挑取步驟4中革蘭氏染色陰性的菌落的另一部分，直接接種于

17、復發(fā)酵管中，注意做好編號記錄，放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。實驗六內容安排：復發(fā)酵結果的觀察和大腸菌群數目的MPN統(tǒng)計時間：12月4日8:00到10:00步驟和注意事項：1.復發(fā)酵結果的觀察記錄按照實驗三中步驟2的方式進行復發(fā)酵實驗結果（參照P418頁產酸產氣情況分析）的記錄。2.大腸菌群數目的MPN統(tǒng)計依據步驟1的結果，根據附錄六表3（P450頁），報告總大腸桿菌群數。結果與分析采樣記錄表1水樣采集記錄表（1）西安醫(yī)學院采樣記錄表觀測項目水樣編號1水樣編號2水樣編號3采集時間11:1211：3011:35采集時溫度10.810.89.7采集地點ABC水體顏色淡黃色淡黃色淡黃色水體渾濁度輕度渾濁輕

18、度渾濁輕度渾濁水體面積180平米180平米180平米水體漂浮物（有無大面積藻類）無無無水體pH值7.07.07.1水體周圍環(huán)境（人員流動密度）較多較多較多（2）西安工業(yè)大學采樣記錄表觀測項目水樣編號1水樣編號2水樣編號3采集時間10：0010：0210：17采集時溫度666水體顏色黃綠色黃綠色黃綠色水體渾濁度輕度渾濁輕度渾濁輕度渾濁水體漂浮物（有無大面積藻類）無無無水體pH值787878水體周圍環(huán)境（人員流動密度）稀少稀少稀少水樣總細菌群落測定醫(yī)學院（稀釋濃度依次為10-2 10-3 10-4）西安工業(yè)大學表2水樣總細菌群落測定結果記錄表稀釋平均菌落水樣來源稀釋液及菌落數兩稀釋度菌落數之比細菌總數（個/g或個/ml）報告方式（個/g或個/ml）10-210-310-4西安工業(yè)大學-50-500000500000西安醫(yī)學院-235356.71350000350000.大腸菌群檢驗初發(fā)酵結果的觀察初發(fā)酵結果（照片）西安醫(yī)學院西安工業(yè)大學表3初發(fā)酵結果記錄表(1)醫(yī)學院記錄表管號是否變色是否有氣體產生是否渾濁備注1 是是是可疑陽性2 否否是可疑陽性3 否否否陰性（2）西安工業(yè)大學管號是否變色是否有氣體產生是否渾濁備注1 是是是可疑陽性2 否否是可疑陽性3 否否否陰性平板分離