水蛭素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

1、水蛭素在畢赤酵母中的分泌表達(dá) 作者：龍銦，劉家云，劉莉，王宗仁 【關(guān)鍵詞】 畢赤酵母 Secretory expression of hirudins in Pichia pastoris【Abstract】 AIM: To construct hirudin expression vectors and obtain its secretory expression in Pichia pastoris(P. pastoris). METHODS: Hirudin HV2 and HV2N47K genes were amplified by PCR and the correct gene

2、s were fused to pPIC9 factor signal and subcloned into pPIC9K secretory expression vector. The constructs were transformed into P. pastoris strain GSM1168, stable multicopy integrants were screened on medium containing increasing concentrations of G418. Then the screenedout clones were induced by me

3、thanol to express hirudin proteins. The supernatants of expression products were identified by SDSPAGE and Western blot analysis, and its antithrombotic activity was determined too. RESULTS: The expression vectors were successfully constructed, hirudins were expressed in supernatants of P. pastoris,

4、 and the expression products possessed antithrombotic activity. CONCLUSION: Hirudins can be expressed secretorily in P. pastoris, which offers a basis for newdrug researches.【Keywords】 hirudin; Pichia; secretory expression【摘要】 目的： 構(gòu)建水蛭素畢赤酵母表達(dá)載體，獲得重組蛋白在畢赤酵母中的分泌型表達(dá). 方法： 通過PCR擴(kuò)增獲得水蛭素HV2, HV2N47K基因，將序列正

5、確的基因序列插入酵母表達(dá)載體pPIC9分泌信號下游，再亞克隆入高拷貝載體pPIC9K，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KHV2, pPIC9KHV2N47K. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌GSM1168，G418抗性篩選高拷貝的穩(wěn)定表達(dá)菌株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定. 結(jié)果： 成功構(gòu)建了水蛭素畢赤酵母表達(dá)載體，獲得水蛭素在畢赤酵母中的分泌型表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有抗凝血酶活性. 結(jié)論： 水蛭素在畢赤酵母中獲得分泌型表達(dá)，為研究新藥奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 水蛭素；畢赤酵母；分泌表達(dá)0引言水蛭素(hirudin)是從水蛭（Hirudo medicinalis）中分離出的抗凝血活性成分，是凝血酶的天然抑制劑1，具

6、有高效的抗血栓形成作用和非常廣闊的應(yīng)用前景2-3. 但是天然水蛭素來源匱乏，限制了其研究和臨床應(yīng)用，我們以水蛭素HV2, HV2N47K的氨基酸序列為對象，通過PCR擴(kuò)增得到了目的基因，克隆入畢赤酵母(Pichia Pastoris)表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建了水蛭素酵母分泌型表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化SMD1168畢赤酵母細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了具有抗凝血酶活性的表達(dá)產(chǎn)物，為水蛭素的研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料質(zhì)粒pPIC9, pPIC9K, Top10F菌株及畢赤酵母菌SMD1168由本實驗室保存. TaKaRa Taq酶，限制性內(nèi)切酶（EcoRI, XhoI, BamHI,

7、Sa1I），T4 DNA連接酶均購自寶生物公司. 發(fā)色底物Chromozym TH及ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Roche公司，鼠抗hirudin單抗(mAb) 購自AntibodyShop公司，酵母基因組DNA純化試劑盒購自上海華舜生物工程公司. 電泳儀、電轉(zhuǎn)儀均為BioRad公司產(chǎn)品. 引物合成及DNA測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司完成.1.2方法1.2.1水蛭素基因的獲取根據(jù)水蛭素HV2的氨基酸序列，按照文獻(xiàn)4方法，采用分段合成寡核苷酸片段，互補(bǔ)寡核苷酸片段的退火配對后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增而獲得HV2基因. HV2N47K是經(jīng)過DNA改組和噬菌體親和篩選獲得的具有較高抗凝血酶活性的水蛭素變異

8、體5，HV2N47K基因經(jīng)PCR從pCANTAB5EHV2N47K載體中獲取. 用于PCR擴(kuò)增的上游引物P1：5 CTCTCGAGAAAAGAATTACTTAC 3，引入XhoI酶切位點，下游引物P2：5GGGAATTCCTATTGTAAATATTC 3，引入EcoRI位點. PCR擴(kuò)增參數(shù)： 94變性45 s，55退火45 s，72延伸50 s，共進(jìn)行30個循環(huán). 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定.1.2.2酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物用EcoRI和XhoI雙酶切，回收目的片段，插入經(jīng)相同酶切的pPIC9載體，轉(zhuǎn)化宿主菌TOP10F，提取質(zhì)粒，酶切鑒定含有全長HV1基

9、因的重組子，并將其送上海生工生物工程公司測序. DNA測序正確后(命名為pPIC9HV1)，再經(jīng)BamHI, SalI酶切后定向插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，得到高拷貝表達(dá)載體pPIC9KHV2.1.2.3酵母菌的轉(zhuǎn)化及高拷貝整合菌株的篩選挑取GSM1168單菌落接種于10 mL YPD中，30振蕩過夜，1%體積轉(zhuǎn)接至100 mL YPD中擴(kuò)大培養(yǎng)至A600=1.0；菌液于4，1000 g離心5 min，菌體依次用50 mL預(yù)冷的去離子水和10 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇洗滌，最后將細(xì)胞重懸于1.0 mL預(yù)冷的山梨醇溶液中. SalI線性化的pPIC9KHV1及空載體pPIC9K各10

10、 g分別與100 L酵母細(xì)胞混勻，加入電轉(zhuǎn)杯，冰浴5 min，BioRad電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化，電擊結(jié)束后立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液，混勻. 取0.5 mL轉(zhuǎn)化物涂布于MD（13.4 g/L YNB, 4×10-4 g/L Biotin, 20 g/L Dextrose, 20 g/L瓊脂，1 mol/L山梨醇）選擇平板上，30培養(yǎng)24 d，觀察轉(zhuǎn)化子的生長. 再將MD平板上生長的陽性克隆依次轉(zhuǎn)種至含1, 2, 3, 4, 5 g/L G418的MD平板上，以在高濃度G418上正常生長的菌落為高拷貝整合菌株. 挑取高拷貝整合單菌落進(jìn)行擴(kuò)增，提取其基因組DNA，分別用P1和

11、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.1.2.4表達(dá)菌株的培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)取鑒定的單克隆菌株于2 mL YPD中，30 250 r/min搖床培養(yǎng)過液，再以1%的量接種于10 mL BMGY培養(yǎng)液(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，10 g/L甘油，13.4 g/L YNB, 0.4 mg/L生物素，0.1mol/L磷酸鉀緩沖液) 中，于30, 250 r/min的搖床上培養(yǎng)至A600為48. 離心收集菌體，棄去BMGY培養(yǎng)基，更換為20 mL BMMY培養(yǎng)液(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液，13.4 g/L YNB， 0.4 mg/L生物素，5 mL/L

12、甲醇) 于30誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h加入甲醇0.1mL（終濃度為50 mL/L, V/V）并取樣，離心收集上清進(jìn)行SDSPAGE鑒定.1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的分析表達(dá)菌株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，取表達(dá)上清進(jìn)行15%的SDSPAGE電泳，用轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液37處理膜2 h，漂洗后加人兔抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的多克隆抗體于37孵育1 h. 用PBS漂洗后，加入鼠抗hirudin mAb和HRP羊抗鼠IgG室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光底物壓片曝光，顯影后觀察結(jié)果.1.2.6表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測取誘導(dǎo)表達(dá)的酵母上清液50 L，凝血酶50 L（60 U/L）加入到1 mL反應(yīng)緩沖液（50

13、mmol/L TrisHCl pH 8.3， 0.2 mol/L NaCl）中，37保溫5 min，加入發(fā)色底物Chromozym TH, 405 nm波長下測定表達(dá)產(chǎn)物的活性，結(jié)果以每分鐘A值的變化A405/min表示.2結(jié)果2.1水蛭素基因的獲取參照水蛭素HV2的氨基酸序列，分段合成的寡核苷酸片段磷酸化后，互補(bǔ)配對的堿基經(jīng)退火形成雙鏈DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得約220 bp的基因片段；同理，經(jīng)PCR從pCANTAB5EHV2N47K載體中擴(kuò)增，獲得HV2N47K基因片段（圖1）.1: HV2基因PCR結(jié)果；2: HV2N47K基因PCR結(jié)果；3: pPIC9HV2；4: pPIC9HV2N

14、47K；5: pPIC9；6: pPIC9KHV2；7: pPIC9KHV2N47K；8: pPIC9K；M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；: HindIII酶切片斷. 圖1目的基因的獲取及表達(dá)載體的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定結(jié)果（略）2.2酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定HV2, HV2N47K基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切，插入pPIC9載體，轉(zhuǎn)化宿主菌TOP10F，提取質(zhì)粒，DNA測序結(jié)果表明所得到的水蛭素基因與預(yù)期序列完全一致. 序列正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9HV2, pPIC9HV2N47K，后者經(jīng)BamHI, SalI酶切后定向插入pPIC9K，得到高拷貝表達(dá)載

15、體pPIC9KHV2, pPIC9KHV2N47K，經(jīng)XhoI, EcoRI雙酶切鑒定，得到約220 bp的目的基因片段和被切成約4.6 kb的兩個載體片段(圖1)，表明目的基因已正確克隆入表達(dá)載體中.2.3GSM1168的轉(zhuǎn)化及高拷貝整合菌株的篩選SalI線性化的pPIC9KHV2, pPIC9KHV2N47K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GSM1168感受態(tài)細(xì)胞，在MDS平板上培養(yǎng)，得到His+轉(zhuǎn)化菌落，將轉(zhuǎn)化的His+菌落點種至含G418濃度為1, 2, 3, 4, 5 g/L的MD平板上，隨G418濃度的增加，GSM1168轉(zhuǎn)化His+菌生長速度出現(xiàn)差異. 取5 g/L G418平板上生長的菌落增菌培養(yǎng)，提

16、取酵母基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果以P1和P2引物所進(jìn)行的PCR擴(kuò)增均為陽性（圖2），提示水蛭素基因已成功整合到畢赤酵母染色體中.M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,8: SMD1168；24: pPIC9KHV2整合克隆；57: pPIC9KHV2N47K整合克隆.圖2PCR鑒定目的基因的整合（略）2.4水蛭素的誘導(dǎo)表達(dá)重組有水蛭素基因的酵母菌株GSM1168經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后于培養(yǎng)基中可檢出Mr約為7000的蛋白質(zhì)，該蛋白在培養(yǎng)基中的含量隨誘導(dǎo)時間的延長而增多，在誘導(dǎo)表達(dá)120 h后接近峰值. 經(jīng)Western blot鑒定表達(dá)的蛋白能與鼠抗hirudin mAb結(jié)合，提示水蛭素在畢

17、赤酵母菌SMD1168中獲得分泌性表達(dá)（圖3）.A: 表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析；B：表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定. M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: pPIC9HV2誘導(dǎo)72 h培養(yǎng)上清；2: pPIC9HV2未誘導(dǎo)培養(yǎng)上清；3: pPIC9HV2N47K誘導(dǎo)120 h培養(yǎng)上清；4: pPIC9HV2誘導(dǎo)72 h培養(yǎng)上清；5: pPIC9HV2N47K誘導(dǎo)120 h培養(yǎng)上清.圖3表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE和Western blot鑒定（略）2.5表達(dá)產(chǎn)物的抗凝血酶活性分析酵母誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物采用發(fā)色底物Chromozym TH測定其抗凝血酶活性，水蛭素HV2和HV2N47K表達(dá)上清的A405

18、/min分別為0.268, 0.457，表明表達(dá)產(chǎn)物具有抗凝血酶活性，且HV2N47K的活性比HV2強(qiáng).3討論巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)是一種近年來廣泛使用的真核基因表達(dá)系統(tǒng)，它具有表達(dá)效率高、遺傳穩(wěn)定性好、糖基化適中、表達(dá)產(chǎn)物可分泌以及發(fā)酵工藝成熟等許多優(yōu)點，尤其是在分泌表達(dá)方面，由于自身細(xì)胞分泌的蛋白少，重組蛋白分泌量高，適合工業(yè)生產(chǎn)時的高密度發(fā)酵，有利于下游純化. 因此，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來被公認(rèn)的最有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得了成功表達(dá)6. 畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油時，能利用甲醇作為惟一碳源，其甲醇

19、利用的關(guān)鍵基因醇氧化酶基因（AOX1）的表達(dá)量可占細(xì)胞總mRNA的5%，該酶可占細(xì)胞總蛋白的30%以上，AOX1啟動子受甲醇的嚴(yán)格誘導(dǎo)表達(dá)，被廣泛用于驅(qū)動外源蛋白的高效表達(dá)，pPIC9, pPIC9K表達(dá)載體即采用了AOX1高效表達(dá)啟動子7. 實驗中我們將水蛭素基因插入pPIC9 分泌信號下游，利用AOX1高效啟動子使目的基因能在酵母中高效分泌表達(dá).在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，外源基因是通過同源重組整合到宿主菌的染色體上的，因而構(gòu)建的表達(dá)菌株穩(wěn)定性很高. 載體與酵母染色體的同源重組有兩種方式： 一是線性化載體與宿主染色體發(fā)生雙交換，取代宿主染色體AOX1基因；另一種是經(jīng)單交換插入宿主染色體的AOX1

20、位點或His4位點. 單交換轉(zhuǎn)化效率比雙交換高，且易得到多拷貝整合. 一般來講，整合的拷貝數(shù)越多，表達(dá)量越高8. 我們采用SalI單酶切使表達(dá)載體線性化，表達(dá)框與宿主基因組發(fā)生單交換而整合于染色體中. 由于pPIC9K載體帶有卡那抗性基因，使陽性轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)生G418抗性，且整合的拷貝數(shù)與G418抗性之間有一定的計量依賴關(guān)系，通過提高G418濃度，容易篩選到高拷貝穩(wěn)定整合菌株?實驗結(jié)果表明，表達(dá)菌株即使在非選擇性培養(yǎng)基中經(jīng)120h誘導(dǎo)培養(yǎng)，仍能夠有效地分泌具有生物學(xué)活性的目的蛋白.我們通過PCR擴(kuò)增得到了目的基因，成功構(gòu)建了水蛭素HV2, HV2N47K畢赤酵母表達(dá)載體，經(jīng)抗性篩選獲得穩(wěn)定整合菌株

21、并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了具有抗凝血酶活性的表達(dá)產(chǎn)物，為水蛭素的新藥研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Markwardt F. Hirudin as alternative anticoagulanta historical reviewJ. Semin Thromb Hemost, 2002,28(5):405-414.2 Sohn JH, Kang HA, Rao KJ, et al. Current status of the anticoagulant hirudin: its biotechnological production and clinical practiceJ. Appl Microbiol Biotechnol, 2001,57(56):606-613.3 Yavin YY, Wolozinsky M, Cohen AT. New antithrombotics in the prevent