益氣化淤中藥對(duì)大鼠胃癌前病變蛋白激酶C蛋白表達(dá)的影響

1、益氣化淤中藥對(duì)大鼠胃癌前病變蛋白激酶C蛋白表達(dá)的影響【摘要】 目的觀察益氣化淤中藥對(duì)大鼠胃癌前病變胃黏膜蛋白激酶C（PKC）表達(dá)的影響。方法采用MNNG、乙醇、饑飽失常等多因素造模。造模型成功后，將造模存活大鼠隨機(jī)分為自然恢復(fù)組，中藥高、中、低劑量組, 各組大鼠作相應(yīng)的處理后, 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠胃黏膜組織PKC表達(dá)水平。結(jié)果各治療組PKC表達(dá)較自然恢復(fù)組下調(diào),有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論益氣化瘀中藥可能是下調(diào)PKC的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而發(fā)揮對(duì)大鼠胃癌前病變的治療作用。 【關(guān)鍵詞】 胃癌前病變 蛋白激酶C 益氣化淤中藥Abstract：ObjectiveTo o

2、bserve the effect of Yiqi Huayu Recipe on the expression of protein kinase C(PKC) in rats with gastric precancerous lesions(GPL).MethodsThe model of GPL was established mainly through N-methyl-N-nitro N-nitrosoguanidine (MNNG) together with other factors including alcohol stimulation and undue hunge

3、r and overeating. The survived rats after modeling were randomly divided into spontaneous recovery, and high-, moderate-and low-dose of Yiqi Huayu Recipe group. After the corresponding treatment, the expression of PKC was detected by immunohistochemical method. ResultsThe expression of PKC in each t

4、reatment group were distinctly lower than that in spontaneous recovery group (P<0.05).ConclusionYiqi Huayu Recipe is effective in the treatment of rats with GPL by inhibiting the expression of PKC.Key words：Gastric precancerous lesions; Protein kinase C; Yiqi Huayu Recipe 慢性萎縮性胃炎（CAG）伴中重度不典型增生或/和

5、不完全性結(jié)腸型化生是胃癌的重要癌前病變。益氣化淤中藥臨床治療胃癌前病變?nèi)〉昧撕芎玫闹委熜Ч?，為了探討其作用機(jī)制，特設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。1 材料與方法1.1 藥物及試劑甲硝基亞硝基胍(MNNG)為Fluka公司產(chǎn)品，每周用雙蒸水配成1 g/L的母液4避光儲(chǔ)存，臨用時(shí)用雙蒸水配成所需濃度；脫氧膽酸鈉購自湖北省醫(yī)藥公司；雷尼替丁由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn)；PKC小鼠抗大鼠單克隆抗體為SantaGruz 公司產(chǎn)品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶標(biāo)記鏈親合素(三抗)、DAB、封閉用山羊血清等為博士德試劑公司產(chǎn)品。益氣化淤中藥主要由太子參、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等組成，

6、濃度2 gml。1.2 造模及給藥方法選用SPF級(jí)6周齡SD大鼠62只，體質(zhì)量100120 g。造模參照嚴(yán)茂祥等26綜合造模方法并加以改進(jìn)。大鼠自購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d。從62只大鼠中隨機(jī)抽取13只作為正常組, 其余49只用于造模。正常組大鼠不做任何處理；造模大鼠每日自由飲用100 mg/L MNNG液(飲料瓶用油漆涂黑避光)、進(jìn)食含0.3 g/L雷尼替丁的純鼠飼料、上午用56 150 g/L的氯化鈉液按10 ml/kg灌胃，進(jìn)食2 d，禁食1 d，進(jìn)食當(dāng)天下午用8.5 g/L脫氧膽酸鈉溶液按10 ml/kg灌胃。禁食當(dāng)天下午用400 ml/L乙醇按10 ml/kg灌胃，連續(xù)24周。24周末時(shí)

7、隨機(jī)抽取正常組和造模大鼠各1只，殺檢，觀察組織病理學(xué)變化(以HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)果為主)，確認(rèn)模型是否成功。造模型成功后，將造模存活的48只大鼠隨機(jī)分為自然恢復(fù)組12只。中藥高、中、低劑量組(簡(jiǎn)稱高、中、低劑量組)各12只。高劑量組每日每只按20 g/kg(相當(dāng)于成人1 d用量的兩倍)灌胃，中劑量組按10 g/kg(相當(dāng)于成人1 d用量)灌胃，低劑量組按5 g/kg(相當(dāng)于成人1 d用量的50%)灌胃。上述治療16周。自然恢復(fù)組同正常組大鼠常規(guī)飲食。40周末所有動(dòng)物禁食1 d，處死，剖腹取胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗，肉眼觀察，平鋪于硬紙板上，于胃竇部剪取組織1塊，40 g/L多聚甲

8、醛固定，石蠟包埋, 切片5 m, 免疫組織化學(xué)染色。1.3 PKC蛋白表達(dá)PKC一抗稀釋倍數(shù)(1100)，染色步驟如下:切片脫蠟入水。3%H2O2室溫孵育1 min,以滅活內(nèi)源性酶。最后蒸餾水洗3次。將切片浸入TAB(0.05 mol/L，pH7.4)中,電爐加熱至100,持續(xù)30 min。冷卻后進(jìn)行下一步。滴加抗原修復(fù)液,室溫孵育10 min，蒸餾水洗3次。滴加正常5%山羊血清封閉液,室溫孵育10 min，甩去多余液體。滴加稀釋的一抗,4濕盒內(nèi)過夜。TAB洗滌3次,每次5 min,滴加二抗室溫孵育30 min。TAB洗滌3次，5 min/次，滴加三抗(HIGH-SABC)室溫孵育30 min

9、。TAB洗滌3次，5 min/次，DAB顯色。自來水沖洗，蘇木復(fù)染，封片。1.4 觀察方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)7加以改進(jìn)。切片中出現(xiàn)黃染為陽性。每張切片由兩位觀察者獨(dú)立計(jì)數(shù),隨機(jī)取染色區(qū)域4個(gè)高倍視野(400)陽性細(xì)胞平均數(shù),用半定量計(jì)分。染色強(qiáng)度用03級(jí)計(jì)分：0級(jí)為無染色；1級(jí)為輕度陽性染色；2級(jí)為中度陽性染色；3級(jí)為強(qiáng)陽性染色；染色范圍根據(jù)細(xì)胞陽性染色的百分?jǐn)?shù)而分為04級(jí)：0級(jí)為無染色；1級(jí)為510細(xì)胞染色；2級(jí)為1020細(xì)胞染色；3級(jí)為2050細(xì)胞染色；4級(jí)為>50細(xì)胞染色。染色總評(píng)分為染色強(qiáng)度+染色范圍。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法數(shù)據(jù)用s表示, 組間差異性比較采用q檢驗(yàn)，P<0.

10、05認(rèn)為有顯著性差異。2 結(jié)果 PKC在正常組中主要存在于胞漿,其他組別中,除了胞漿外，在胞膜和胞核也可見。自然恢復(fù)組較對(duì)照組PKC表達(dá)增強(qiáng),有非常顯著性差異(P<0.01)；各治療組較對(duì)照組PKC表達(dá)增強(qiáng),但沒有顯著性差異(P>0.05)；各治療組較自然恢復(fù)組PKC表達(dá)下調(diào),有顯著性差異(P<0.05)；各治療組之間比較沒有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。表1 各組大鼠的PKC蛋白表達(dá)(略)3 討論蛋白激酶C(PKC)是1977年由日本學(xué)者Nishizuka等8首次在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶,其廣泛分布于真核細(xì)胞中,由多種具有不同生物學(xué)

11、特性的同工酶組成,是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要遞質(zhì)。PKC通常處于失活狀態(tài),被激活后可由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜,能夠使眾多蛋白質(zhì)中的絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生磷酸化而發(fā)揮作用。PKC的活化不僅與正常細(xì)胞和異常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)， 更在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥等方面發(fā)揮重要作用。有人采用不同濃度的PKC抑制劑Staurosporine(ST)作用于人胃癌細(xì)胞株MGC 803和SGC 7901后,細(xì)胞增殖受到明顯抑制,表明PKC在胃癌細(xì)胞增殖中具有重要作用9。胃癌細(xì)胞增殖時(shí),PKC活性表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì),而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡時(shí),它表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)1012，一些化療藥物和抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的藥

12、物如特異性環(huán)氧化酶 2抑制劑也通過下調(diào)PKC活性而抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)13，14。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以MNNG為主的多因素聯(lián)合攻擊法誘發(fā)的大鼠胃癌前病變(自然恢復(fù)組)粘膜PKC蛋白表達(dá)明顯增高，胃炎消能使PKC蛋白表達(dá)明顯下降(與自然恢復(fù)組比較，P<0.05)，我們推測(cè)胃炎消可能是通過下調(diào)PKC的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而發(fā)揮對(duì)大鼠胃癌前病變的治療作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1胡 玲，黃志新.勞紹賢醫(yī)學(xué)文選M.廣州：廣東科技出版社，2005：201.2嚴(yán)茂祥, 陳芝蕓, 項(xiàng)柏康,等. 大鼠胃黏膜癌前病變模型的建立J.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998,22: 3.3李春?jiǎn)? 劉為紋, 房殿春. 甲硝

13、亞硝胍和/或雷尼替丁誘發(fā)大鼠腺胃黏膜腸上皮化生J.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，1995，4（4）: 254.4石宇, 李連宏. 復(fù)合因素誘發(fā)大鼠胃黏膜癌前病變的動(dòng)物模型J.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2000， 16: 406.5ThompsonC B.Apoptosis in pathogenesis and treatment of diseaseJ.Science, 1995,267:1456.6Potten CS,Booth C.The role of radiation induced and spontaneous apoptosis in the homestasis of thegastr

14、ointestestinal epithelium: a brief reviewJ.Comp Bioche m Physiol Bioche m Mol Biol, 1997,118:473.7Klein IK, Ritland SR, Burgart LJ, et al. Adenoma-specific alterations of protein Kinase C is ozyme expression in Apc(MIN) miceJ.Cancer Res,2000,60(8):2077.8Nishizuka Y, Takai Y, Kishimoto A, et al. A ro

15、le of calcium in the activation of a new protein Kinase system. Adv cyclic Nucleotide ResJ.1978,9:209.9哈敏文，侯柯佐，劉云鵬，等.蛋白激酶C抑制劑Staurosporine對(duì)人胃癌細(xì)胞周期的影響J.癌癥,2003,22(7):691.10邢承忠,陳峻青.胃癌細(xì)胞凋亡過程中PKC活性表達(dá)的變化J.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,28(1):25.11UchidaN,OkamuraS,KuwanoH.Protein kinase C activity in human gastric carcino

16、maJ.Oncol Rep,2000,7(4):793.12Izawa M,Teramachi K.Down-regulation of protein kinase C activity by sorbitol rapidly induce sapoptosis in human gastric cancer cell linesJ.Apoptosis,2001,6(5):353.13Jiang XH,Lam SK,Lin MC,et al.Novel target for induction of apoptosis by cyclo-oxygenase-2 in hibitor SC2236 through aprotein kinaseC beta(1) depen