老年人急性白血病MLL基因與免疫表達異常及預(yù)后的臨床意義

1、老年人急性白血病MLL基因與免疫表達異常及預(yù)后的臨床意義作者：趙峻峰 王立新 張秀瓏 蔡艷霞 房勝春【摘要】 目的 檢測老年人急性白血病患者混合系白血病(MLL)基因表達水平，并對部分患者轉(zhuǎn)錄本進行動態(tài)檢測，以觀察治療后基因表達量的變化，并檢測其免疫表達異常率和比較治療效果及與巢式PCR結(jié)果進行敏感度比較。方法 利用熒光實時定量PCR(RQPCR)技術(shù)檢測MLL融合基因，觀察白血病MLL基因的表達水平，分析MLL基因重排的發(fā)生頻率和免疫表型異常的病例，進行化療。對照MLL基因異常及免疫表達異常的臨床意義。結(jié)果 41例老年白血病中7例檢測到MLL基因，發(fā)生率為17.07%，其中MLLAF6 4例

2、(24.5%);其中4例緩解，其MLL基因中位數(shù)均低于平均值。免疫表達異常在MLL基因中的檢出率較無MLL重排發(fā)生頻率高，為28.8%，發(fā)生率較無MLL基因重排高，且臨床緩解率低?；蛑嘏偶爱惓１磉_與緩解率有關(guān)。結(jié)論 RQPCR監(jiān)測融合基因表達可以有效觀察治療效果，敏感性高，MLL基因重排與白血病分子機制有關(guān)。其次免疫表達異常的患者MLL基因重排檢出率相對較高，其臨床緩解及療效差，可能提示預(yù)后不良。 【關(guān)鍵詞】 急性白血病;MLL基因;免疫表達異常老年人急性白血病是老年人常見的因造血干/祖細胞于分化過程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其往往病情危重

3、，由于年齡因素化學(xué)治療是常見或唯一的治療方式。混合系白血病(MLL)基因，又稱為髓系/淋巴系白血病基因，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與組成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白復(fù)合物。原發(fā)性急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓細胞性白血病(AML)和繼發(fā)性白血病都可以出現(xiàn)MLL基因異常，具有MLL基因異常的白血病稱為MLL相關(guān)白血病。MLL基因重排的致白血病機制目前尚不完全清楚，白血病細胞免疫表型測定是近些年診斷白血病的檢查，不同類型白血病細胞其免疫標記物不同，當出現(xiàn)異常表達時，治療的有效率可能存在差異。本文擬檢測老年人急性白血病MLL基因重排的白血病細胞系以探索MLL基因與白血病免疫表達異常及療效的相互關(guān)系，以揭示白

4、血病中復(fù)雜而多變的致白血病分子機制，并確定其治療意義。1 對象與方法1.1 對象 2005年9月至2010年4月我院血液科確診初發(fā)或復(fù)發(fā)老年急性白血病41例，其中男19例，女22例，年齡6389(中位數(shù)74)歲;ALL 6例，AML 35例;初發(fā)37例，復(fù)發(fā)4例。用多重巢式PCR檢測白血病相關(guān)融合基因及實時定量PCR(RQPCR)分析MLL基因重排的發(fā)生頻率，檢測白血病細胞的免疫表型，總結(jié)其免疫異常表達。所有病例均經(jīng)臨床、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、組織化學(xué)染色、細胞遺傳學(xué)確診。1.2 方法1.2.1 標本采集 對41例老年人白血病的骨髓標本的MLL基因表達水平進行了檢測，其中原始細胞百分比大于70%的2

5、9例，小于70%的12例;將患者分為MLL基因組及無MLL基因組。同時流式細胞儀檢測白血病細胞的免疫表型。進一步分析MLL基因重排的類型、免疫表達異常及療效的關(guān)系，并進行化療?；煼桨笧锳ML為HAA(阿克拉霉素20 mg/d 、14 d，阿糖胞苷0.2/d、17 d，高三尖杉酯堿5 mg/d、17 d)或DEA(阿糖胞苷0.2/d、17 d，柔紅霉素4060 mg/d、13 d，依托泊苷0.1/d、17 d);ALL采用VAP(長春新堿2 mg、d1，潑尼松4060 mg/d、17 d，阿糖胞苷0.2/d、17 d，)、VDP(長春新堿2 mg、d1，柔紅霉素4060 mg/d、13 d，潑

6、尼松4060 mg/d、17 d，)等經(jīng)典治療方案，比較其緩解率。1.2.2 MLL基因表達水平的檢測 制備質(zhì)粒檢測質(zhì)粒及測序：采用常規(guī)TA載體克隆方案，將上述方法所得的融合基因克隆片段裝入T載體中，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌菌株，經(jīng)LB平板篩選，含氨芐西林80 U/ ml培養(yǎng)基培養(yǎng)后抽提、純化重組質(zhì)粒-20備用。對質(zhì)粒行PCR反應(yīng)，行電泳(同上)及測序確證質(zhì)粒含有目的片段。質(zhì)粒標準品的定量與稀釋：運用紫外分光光度儀(UV2100型)對抽提的質(zhì)粒進行定量測定，并根據(jù)公式計算其拷貝數(shù)以注射用蒸餾水連續(xù)10倍稀釋定量的質(zhì)粒，選擇濃度范圍為103108拷貝/l。1.2.3 MLL融合基因表達水平檢測 骨髓經(jīng)淋巴

7、細胞分離液分離得到單個核細胞，采用RNA 純化試劑盒(Gentra公司)提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定A260 nm/A280 nm值。用Primer3 引物設(shè)計軟件設(shè)計MLL、MLLAF9和GAPDH引物，所用cDNA序列為MLL(NM_005933)、AF9(NM_004529.1)和GAPDH(BC025925)。根據(jù)用SyBrGreen進行RTPCR的要求，為取得較高的擴增效率，PCR產(chǎn)物片段大小選擇在200 bp左右，并選用相同的退火溫度，保證這些PCR反應(yīng)能在同一條件下進行。RTPCR前，均進行常規(guī)PCR，確定PCR反應(yīng)條件，并純化PCR產(chǎn)物進行測序，驗證PCR擴增的特異性。1

8、.2.4 流式細胞儀檢測免疫表達 測定異常表達發(fā)生頻率，F(xiàn)ACS Calidur流式細胞儀：BD公司。標本為骨髓或外周血，所用單抗包括髓系CyMPO、CD13、CD33、CD14、CD15,T淋巴細胞系CD3、CD2、CD7、CD5，B淋巴細胞CD19、CD20、CD10、CD79A、CyCD22，CD34，結(jié)果判斷陽性細胞>20%為陽性。具體方法參照文獻1。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包，由于緩解期患者的原始細胞比例明顯降低，未經(jīng)分選的骨髓單個核細胞很難反映白血病細胞的特征，因此只選用原始細胞比例大于75%的初發(fā)或復(fù)發(fā)患者資料進行非參數(shù)的秩和檢驗(StudentNe

9、wmanKeuls檢驗)，并進行兩兩間秩和檢驗。2 結(jié) 果2.1 不同F(xiàn)AB分型的白血病MLL基因異常的發(fā)生頻率 在非選擇性取樣的41例老年性急性白血病患者中，MLL重排的發(fā)生頻率為17.07%，主要見于M4和M5型。AML中FAB分型情況與MLL基因重排的發(fā)生頻率見表1，共檢測到MLL重排7例，其中35例AML中有6例重排，發(fā)生頻率為17.14%;6例ALL有1例重排，發(fā)生頻率為16.67%,1例混合型白血病測到MLL基因;表明MLL基因重排可發(fā)生于AML、ALL。發(fā)現(xiàn)MLL重排見于M4、M5，發(fā)生頻率分別為18.18%、37.5%，而M1、M2和M3均未檢出MLL重排。見表1。表1 不同F(xiàn)

10、AB分型的白血病MLL基因異常的發(fā)生頻率2.2 各組病例MLL基因異常的類型 41例老年白血病中7例檢測到MLL基因，發(fā)生率為17.07%，其中MLLAF6 4例(24.5%)。這組病例中MLL基因重排比例高。其中4例完全緩解，其MLL基因中位數(shù)均低于平均值，5例治療無效，2例2療程化療后未緩解自動出院;緩解率36.45%。16例M5未檢測到MLL基因，其中9例完全緩解，2例部分緩解，3例無效，1例死亡，緩解率73.3%。緩解率有明顯差異(P<0.05)。將緩解后病例再次進行MLL融合基因表達水平檢測，發(fā)現(xiàn)僅檢測到2例仍有MLL異常(重排組)，為MLLAF6融合基因。見表2。表2 各組病

11、例MLL基因異常的類型2.3 初發(fā)白血病組MLL表達水平 初發(fā)白血病組MLL表達水平222.14(50.391 374.75)106,n=41與緩解期組159.19(6.37166.08)106,n=4進行秩和檢驗(P=0.004)，有顯著增高趨勢。2.4 流式細胞儀檢測免疫表達測定異常表達發(fā)生頻率 41例老年性急性白血病患者中，免疫表達異常發(fā)生頻率為19.51%，主要見于混合型、M2、M4和M5型。AML中FAB分型情況與免疫表達測定、MLL基因重排的發(fā)生頻率見表3。共檢測到免疫表達異常8例，其中有2例伴MLL重排，發(fā)生頻率為4.87%，均未緩解;6例ALL有1例免疫異常表達，此例未測到ML

12、L基因，發(fā)生頻率為16.67%，1例混合型白血病測到免疫異常表達及MLL基因;MLL基因表達中免疫表達異常發(fā)生率25%，發(fā)生率較高;表明二者提示預(yù)后差。表3 老年人急性白血病MLL基因2.5 RQPCR測定的重復(fù)性和穩(wěn)定性分析 根據(jù)待測基因的豐度，選擇不同濃度10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標準品進行RQPCR測定，用已知拷貝數(shù)和測定的CT值，繪制標準曲線。GAPDH所用標準品濃度為用104108拷貝/l，而MLL用102107拷貝/l。在所選范圍內(nèi)，質(zhì)粒準品的CT值與起始模板量的對數(shù)呈很好的線性相關(guān)， PCR擴增的線性關(guān)系保持良好。GAPDH標準曲線的斜率接近-3.28，表明擴增效率高，而MLL基因標準

13、曲線的斜率在-3.17左右，擴增效率稍低。實驗中，GAPDH、MLL標準曲線的重復(fù)性好，保證了不同批次間的標本定量值有良好的重復(fù)性，相應(yīng)的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)見表4。表4 GAPDH、MLL標準曲線的重復(fù)性3 討 論免疫表達是目前免疫分型常用的診斷方法，通過對白血病細胞大量表面抗原的測定，確定其細胞分型，確定化療方案，判斷預(yù)后。MLL相關(guān)白血病通常進展迅速，近些年研究認為，MLL相關(guān)白血病在形態(tài)學(xué)，基因表達譜研究也揭示MLL相關(guān)白血病是一種獨立的白血病亞群2。MLL相關(guān)白血病是指具有MLL基因異常的白血病，這些異常最常見的是平衡易位，引起編碼MLL基因氨基端部分的基因組序列與另一個配體基因的羧

14、基端融合，當這些外顯子轉(zhuǎn)錄、剪切和翻譯后，產(chǎn)生一個讀碼框正確的具有癌基因活性的融合蛋白;其次是MLL與自身融合形成部分串聯(lián)重復(fù)，即MLL PTD，通常出現(xiàn)于沒有染色體易位的正常核型或11號染色體三體白血病患者;有些病例還可見到MLL基因的擴增2，3。在嬰兒、兒童和成人的ALL和AML以及拓撲異構(gòu)酶抑制劑治療引起的繼發(fā)性白血病中，都可以出現(xiàn)MLL基因異常，一般認為在AML中MLL融合基因的發(fā)生頻率為5%10%，而ALL中也約為8%10%。其中在小于1歲的嬰兒白血病中，70%80%有MLL融合基因，另外在繼發(fā)性白血病中MLL重排的發(fā)生率也很高，大約占50%，尤其是繼發(fā)于拓撲異構(gòu)酶抑制劑的白血病4。

15、AML病例大約還有10%具有MLL PTD，而沒有明顯重排的MLL基因擴增發(fā)生率低5。我們用多重巢式PCR能同時檢測的MLL重排類型包括MLLAFX、AF1、AF4、AF6、AF9、AF10、ELL、ENL以及PTD。在41例老年性白血病中，發(fā)生頻率為17.07%，較文獻報道6高，可能與病例選擇有關(guān)。MLL相關(guān)白血病通常病程進展迅速，預(yù)后較沒有重排的患者差。不同類型的白血病代表造血細胞分化某一階段后發(fā)生了白血病，但是MLL基因在不同類型白血病中表達情況的相關(guān)研究很少，迄今還沒有定量檢測的報道，也沒有在不同白血病中MLL表達水平有無差異的報道。究其原因可能是由于MLL基因在多種組織表達7，8，而

16、且在各型白血病中均有表達，表達水平差異不大，常規(guī)PCR難以發(fā)現(xiàn)這種差異，只有RQPCR的方法才有可能發(fā)現(xiàn)。李志剛等9在49例兒童AML中檢出11例MLL重排，其中3例MLLAF9陽性。流式細胞儀檢測免疫表達是目前免疫分型常用的診斷方法，通過對白血病細胞測定其細胞分型，確定化療方案，判斷預(yù)后。常用的標記物有所用單抗包括髓系CyMPO、CD13、CD33、CD14、CD15,T淋巴細胞系CD3、CD2、CD7、CD5，B淋巴細胞CD19、CD20、CD10、CD79A、CyCD22，CD34。目前針對免疫表達異常預(yù)示白血病預(yù)后各實驗室報道有差異1。綜上，我們發(fā)現(xiàn)老年人急性白血病MLL基因重排發(fā)生率

17、較高，可能與白血病發(fā)生有關(guān)。免疫表達異常在MLL基因中的檢出率較無MLL重排發(fā)生頻率較高，且臨床緩解率低，療效差。二者可能提示預(yù)后不良?！緟⒖嘉墨I】 1 Reading CL,Estey EH,Huh YO,et al.Expression of unusual immunophenotype combinations in acute myelogenous leukemiaJ.Blood,1993;81:308390.2 Ayton PM，Cleary ML.Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion prot

18、einsJ.Oncogene，2001;(20)：5695707.3 Hess JL.MLL：a histone methyltransferase disrupted in leukemiaJ. Trends Molecular Med，2004;(10)：5007.4 Felix CA.Leukemias related to treatment with DNA topoisomerase inhibitorsJ.Med Pediatr Oncol，2001;36:52535.5 Daser A，Rabbitts TH.The versatile mixed lineage leukaemia gene MLL and its many associations in leukaemogenesisJ.Seminars Cancer Biol，2005;15:17588.6 Schoch C，Schnittger S，Klaus M,et al.AML with 11q23/MLL abnormalit