辛伐他汀對腎移植后高脂血癥患者RANTES及其受體CCR5mRNA表達的影響

1、辛伐他汀對腎移植后高脂血癥患者RANTES及其受體CCR5 mRNA表達的影響 作者：史艷玲, 鄒和群, 王玉新, 徐琴君, 唐孝達 【關鍵詞】 ,腎移植 Effect of simvastatin on expression of RANTES and its receptor CCR5 mRNA in renal transplant recipients with hyperlipidemia【Abstract】 AIM: To study whether hyperlipidemia after renal transplantation is related to the expre

2、ssion of RANTES (regulated on activation normal Tcell expressed and secreted) and its receptor CCR5 (chemokine receptor 5) mRNA in peripheral monocyte cells (PMCs) and to explore its therapy. METHODS: Renal recipients were divided into normal lipidemia group (n=30) and hyperlipidemia group (n=30) ac

3、cording to the serum lipid level 6-8 months after transplantation. The patients in the hyperlipidemia group were treated with simvastatin for 1.5 months (1.5month treatment group) or 3 months (3month treatment group). The control group consisted of 30 healthy subjects. Serum total cholesterol (TC),

4、triglyceride (TG), lowdensity lipoprotein (LDL), highdensity lipoprotein (HDL) were measured and RTPCR was used to detect the expression of RANTES and CCR5 mRNA in PMCs. RESULTS: The renal function of all the patients was normal. TC, TG, LDL and expression of RANTES and CCR5 mRNA in the normal lipid

5、emia group were lower than those in the hyperlipidemia group, but higher than those in control group (P<0.05), and those in 3month treatment group were significantly lower than those in 1.5month treatment group (P<0.05). CONCLUSION: The expression of RANTES and CCR5 mRNA is involved in

6、 the earlystage chronic injury of kidney allografts. Hyperlipidemia can strengthen the increased expression of RANTES and CCR5 mRNA. Simvastatin can reduce the expression of RANTES and CCR5 mRNA in the kidney transplant recipients with hyperlipidemia.【Keywords】 kidney transplantation；hyperlipidemia；

7、RANTES；RTPCR；simvastatin【摘要】 目的: 探討腎移植術后高脂血癥患者外周血RANTES (regulated on activation normal Tcell expressed and secreted)及其受體CCR5(chemokine receptor 5) mRNA表達及治療. 方法: 根據(jù)患者腎移植術后68 mo的血脂水平分血脂正常組（n=30）和血脂增高組（n=30），血脂增高組又根據(jù)辛伐他汀治療時間分1.5 mo治療組（n=30）和3 mo治療組（n=30），并設正常對照組（n=30），利用RTPCR檢測各組患者外周血RANTES和CCR5 mRNA

8、表達水平. 結果: 各組腎功能正常，膽固醇酯，三酰甘油，低密度脂蛋白水平均按對照組，血脂正常組，血脂增高組順序遞增(P<0.05)，3 mo治療組較1.5 mo治療組有顯著降低(P<0.05)；RANTES及其受體CCR5 mRNA表達水平按對照組，血脂正常組，血脂增高組順序遞增，1.5 mo治療組和3 mo治療組均較血脂增高組有顯著降低（P<0.05)，而3 mo治療組又明顯低于1.5 mo治療組(P<0.05). 結論： RANTES及其受體CCR5 mRNA表達可能在移植腎慢性損傷早期起作用；高脂血癥能加重已增高表達，辛伐他汀治療可

9、降低表達.【關鍵詞】 腎移植；高脂血癥；RANTES；逆轉錄聚合酶鏈反應；辛伐他汀0引言腎移植后約半數(shù)以上患者發(fā)生脂代謝紊亂，主要表現(xiàn)為膽固醇（cholesterol, CH），三酰甘油(triglyceride, TG)，低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）升高，高密度脂蛋白（HDL）降低1. 高脂血癥不但是移植后心血管疾病發(fā)生的危險因子，也是移植腎慢性排斥發(fā)生的重要原因2. 趨化因子（chemokine）受體CCR5（chemokine receptor 5）是RANTES（regulated on activation normal Tcell expressed and

10、secreted）的主要受體. 我們應用RTPCR方法檢測腎移植術后高脂血癥患者外周血中RANTES及其受體CCR5 mRNA水平，并觀察辛伐他汀降脂治療對其影響如下.1材料和方法1.1材料腎移植患者60例，原發(fā)病為慢性腎小球腎炎，移植前血清總膽固醇（total cholesterol,TC），TG水平正常；術后68 mo： 血脂正常組：TC<5.85 mmol/L或(和)TG<1.70 mmol/L，30（男16，女14）例，年齡（40±10）歲；血脂增高組：TC>5.85 mmol/L或(和)TG>1.70 mmol/L，3

11、0（男17，女13）例，年齡（41±9）歲；血脂增高組予辛伐他汀治療1.5 mo和3 mo時收集標本，即為1.5 mo治療組和3 mo治療組. 對照組為健康體檢者30(男15，女15)例，年齡（40±9）歲. 抽取空腹靜脈血，分成2份，一份檢測血脂水平，一份分離外周單個核細胞(peripheral mononuclear cell, PMNC) 抽提總RNA. 抽血前1 mo內(nèi)無感染性疾病史. 淋巴細胞分離液Ficol購自上海生物制品所；Trizol，氯仿，異丙醇，MMLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑，0.1 mol/L DTT，隨機引物，dNTP，購自Gibco公司；Taq

12、DNA聚合酶，2.5 mmol/L MgCl2，瓊脂糖，購自Promega公司.1.2方法血標本抽取PMNC轉移至無Rnase的Ependoff管中，加Trizol 1 mL，劇烈震蕩，室溫放置5 min，加氯仿0.2 mL，2000 g 4離心15 min. 轉移上清液至另一Ependoff管中，加異丙醇0.5 mL，室溫靜置10 min，12 000 g, 4離心15 min，棄去上清液，加750 mL/L乙醇1 mL，12 000 g, 4離心10 min；棄去上清液，室溫干燥510 min，加EDPC水20 L混勻，取1 L以純水稀釋100倍，紫外分光光度計測A值與RNA濃度. RTP

13、CR引物：Nucleotide上查找RANTES和CCR5基因序列，Primer3軟件設計，Takara公司合成. 引物序列及擴增產(chǎn)物長度如下：RANTES上游引物 AGCTACTCGGGAGGCTAAGG，下游引物GAGGCATGCTGACTTCCTTC，產(chǎn)物長度276 bp；CCR5上游引物TAGTCATCTTGGGGCTGGTC，下游引物TGTAGGGAGCCCAGAAGAGA，產(chǎn)物長度168 bp；actin上游引物TGGCACACCTTCTACAATGAGCT，下游引物CGTCATACTCCTTGCTCCACATCTGC，產(chǎn)物長度838 bp. 取RNA 1 g,隨機引物1 L,dN

14、TP 1 L，加DEPC水至11.5 L，70預變性5 min；加5×Buffer 5 L, 0.1 mol/L DTT 2 L,RNA酶抑制劑0.5 L,MMLV逆轉錄酶 1 L，37 1 h，95 5 min，加150 L純水稀釋，取1 L紫外分光光度計測A值與cDNA濃度. PCR反應：10×Buffer 5 L,2.5 mmol/L MgCl2 4 L,dNTP 200 mol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U、相應上下游引物各1 L，加雙蒸水至50 L，95預變性3 min，進入循環(huán)：9430 s，57 45 s，72 1 min，共35個循，72保溫10 mi

15、n. PCR產(chǎn)物10 L,actin產(chǎn)物1.5 L, 2 kb DNA Marker 5 L，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外光下觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Synegene tool軟件進行圖像分析，測產(chǎn)物條帶的光密度，計算目標產(chǎn)物與actin的比值.統(tǒng)計學處理：組間比較采用隨機區(qū)組設計方差分析，其余采用完全隨機設計方差分析,如方差不齊采用非參數(shù)KruskalWallis檢驗，并進行各組間的兩兩比較.2結果2.1血脂水平與辛伐他汀治療血脂增高組TC,TG和LDL水平顯著高于對照組及血脂正常組，對照組，血脂正常組間無顯著差異（Tab 1）；3 mo治療組TC,TG和LDL水平顯著低

16、于1.5 mo治療組（P<0.05），3 mo治療組HDL水平明顯高于1.5 mo治療組（P<0.05, Tab 1）.表1血脂增高組辛伐他汀治療后血脂水平及PMNC中RANTES,CCR5 mRNA表達（略）2.2RANTES及CCR5 mRNA表達水平PMNC中RANTES及CCR5 mRNA表達水平按對照組，血脂正常組，血脂增高組的順序遞增，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；辛伐他汀降脂治療1.5 mo治療組，3 mo治療組順序降低，差異有顯著性（P<0.05，Tab 1）.3討論將移植后外周血RANTES及CCR5 mRNA表達水

17、平增高出現(xiàn)在移植腎慢性損傷的臨床癥狀出現(xiàn)之前，而且這些患者在取血之前近期并無感染，腎功能正常，可能是移植腎慢性損傷早期的改變，可能在移植腎慢性損傷早期起作用，也不依賴于高脂血癥，但高脂血癥可加重移植后本已增高的RANTES和CCR5 mRNA表達，且辛伐他汀降脂治療后RANTES和CCR5 mRNA表達降低，提示RANTES和CCR5 mRNA表達增加可能是高脂血癥在移植腎慢性損傷中作用的機制之一. 高脂血癥時高表達的RANTES及CCR5可能通過參與動脈硬化及慢性排斥的發(fā)生機制參與引起移植腎損傷. 動物實驗證實,RANTES/CCR5對動脈粥樣硬化及巨噬細胞浸潤起重要作用3，應用RANTES

18、拮抗劑MetRANTES可減輕小鼠高脂血癥模型動脈粥樣硬化的進展4. 應用RANTES或其受體拮抗劑如MetRANTESD可在一定程度上減輕慢性移植腎病的臨床及病理表現(xiàn)5. 血漿及尿中RANTES的表達與移植腎慢性排斥關系密切，通過檢測血漿及尿中RANTES的表達可以早期發(fā)現(xiàn)移植腎慢性損傷6.【參考文獻】1 Pannu HS, Singh D, Sandhu JS. Lipid pro and after renal transplantationA longitudinal studyJ. Ren Fail, 2003; 25(2):411-417.2 王玉新，陸元善，徐琴君，等. 腎臟移植患者脂代謝紊亂的臨床研究J. 中華腎臟病雜志，2004；20(1):61-62.Wang YX,Lu YS,Xu QJ, et al. Clinical research of lipid metabolic disorder in renal transplantationJ. Chin J Neohrol, 2004; 20(1):61-62.3 Bursill CA, Channon KM, Greaves DR. The