關(guān)于芪丹通脈片聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡及心功能的影響

1、關(guān)于芪丹通脈片聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡及心功能的影響作者：王文,王宗仁,張金洲,李軍昌,蘇海礫,王文勇,馬福成,李靜 【摘要】目的觀察芪丹通脈片聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡、心功能的影響。方法采用密度梯度離心法體外分離培養(yǎng)大鼠MSCs,擴(kuò)增至第3代后,應(yīng)用溴脫氧尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記細(xì)胞。16只健康SD大鼠隨機(jī)分為芪丹通脈片聯(lián)合移植組與單純移植組,分別灌服芪丹通脈片浸膏干粉溶液(2g/kg)和等體積生理鹽水,每日1次,連續(xù)14d。結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支,制備急性心肌梗死模型,將BrdU標(biāo)記的異體MSCs以微量注射的方法移植入

2、缺血心肌內(nèi)。移植后3h應(yīng)用HP5500超聲診斷儀,探頭頻率12MHz,檢測(cè)大鼠心功能,4周后復(fù)查,并用免疫熒光法檢測(cè)缺血區(qū)的微血管密度(MVD),用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果芪丹通脈片聯(lián)合移植組與單純移植組大鼠心功能均有所改善,而芪丹通脈片聯(lián)合移植組改善更明顯(芪丹通脈片聯(lián)合MSCs移植能改善急性心肌缺血大鼠的心功能,減少心肌細(xì)胞凋亡,增加缺血區(qū)MVD,與MSCs單純移植組比較療效更顯著。 【關(guān)鍵詞】芪丹通脈片；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心功能；心肌細(xì)胞凋亡；大鼠 Abstract：ObjectiveToobserveth

3、eeffectofmarrowmesenchymalstemcells(MSCs)transplantationcombinedwithQidantongmaitabletandsimpleMSCstransplantationonmyocardialcellsapoptosisandheartfunctioninacutemyocardialischemiarats.MethodRatMSCswereisolatedbydensitygradientmethod,andthenculturedandamplifiedtothethirdpassagelabeledwithBrdU.16SDr

4、atsweredividedintotwogroupsrandomly,transplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroupandsimpletransplantationgroup.TheisochoricofsuspensionofQidantongmaitablet(2g/kg)andNSwereadministeredtoSDratsbygastrogavagerespectivelyfor14days.Theleftanteriordescendingcoronaryarteryofratwasligatedtoestablishani

5、malmodelsofacutemyocardialinfarction.TheMSCslabeledwithBrdUwereimplantedintramyocardiallyintotheinfarctarea.After3hours,theheartfunctionweredetectedbyanechocardiographicsystem(HP5500system),equippedwitha12MHzprobe.After4weeks,theheartfunctionwererecheckedandMVDweredetectedbyimmunofluorescence,myocar

6、dialcellsapoptosisweredetectedbyTUNNEL.ResultsHeartfunctionwereimprovedinbothgroups,andwasmoresignificantinMSCstransplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroup.ApoptoticindexweredecreasedandtheMVDofischemiczonewereincreasedintransplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroupthansimpletransplantati

7、ongroup.ConclusionMSCstransplantationcombinedwithQidantongmaitabletcouldimproveheartfunctionofacutemyocardialischemiarats,decreaseapoptosisofmyocardialcells,increasetheMVDofischemiczone,thetherapeuticeffectweremoresignificantthansimpleMSCstransplantation. Keywords：Qidantongmaitablet；marrowmesenchyma

8、lstemcells；heartfunction；apoptosisofmyocardialcells；rat 前期研究表明,益氣活血復(fù)方芪丹通脈片含藥血清具有體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用1。本實(shí)驗(yàn)旨在探討芪丹通脈片協(xié)同MSCs移植可否增加局部微血管密度(MVD)及對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡、心功能的影響。 1實(shí)驗(yàn)材料 1.1動(dòng)物 2月齡SD大鼠3只(制備MSCs用),雄性,體質(zhì)量(10020)g；健康成年SD大鼠16只,雄性,體質(zhì)量(25020)g,中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。 1.2藥物 芪丹通脈片浸膏干粉(黃芪30g,丹參30g,當(dāng)歸15g,桂

9、枝10g,紅花30g,此制劑1g相當(dāng)于原材藥2.86g),西京醫(yī)院藥劑科提供。 1.3主要儀器與試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)、二氧化碳孵箱(HERAcell),激光共聚焦顯微鏡,percoll分離液(pharmacia公司),F12-DMEM培養(yǎng)基、進(jìn)口胎牛血清(JIBCO公司),BrdU(pharmacia公司),小鼠抗BrdU單克隆抗體,小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體,FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗,HP5500超聲診斷儀,TUNNEL試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)。 2實(shí)驗(yàn)方法 2.1分組 成年SD大鼠16只分為芪丹通脈片聯(lián)合移植組與單純移植組,造模前分別灌服等體積芪丹通脈片浸膏干粉溶劑(2g原藥材

10、/kg)及生理鹽水14d(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng) 將3只幼齡SD大鼠斷頸處死,浸泡在75%乙醇中5min,取出后用無(wú)菌PBS沖洗鼠體至無(wú)乙醇,在超凈臺(tái)下無(wú)菌取下股骨、脛骨置于平皿中,更換器械及超凈臺(tái),剔除周圍肌肉組織等,用PBS反復(fù)沖洗。剪去骨干兩頭的關(guān)節(jié)面,暴露骨髓腔,用7號(hào)針頭穿刺兩骨端,用5mL含10%FBS的F12-DMEM沖出骨髓入離心管,1500/min離心10min。棄上清,用F12-DMEM重懸細(xì)胞,輕輕疊加到新鮮配制的密度為1.073的percoll分離液上,2500r/min離心30min,收集界面層混濁液,用PBS洗滌2次。然后用F

11、12-DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素)重懸細(xì)胞,按1106/mL的密度接種,37、5%飽和濕度的CO2孵箱培養(yǎng),5d后首次更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁細(xì)胞,34d換液1次,接近融合的MSCs用含0.1mmol/LEDTA的0.25%胰酶室溫消化,按13比例傳代,傳至第3代。MSCs回植前48,換用含5mol/L5-BrdU的F12-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。臨用前加入0.25%胰蛋白酶消化,離心、收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度備用。 2.3造模 2組大鼠于第15日,采用Olivette方法,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈建立急性心肌梗死模型。50mg/kg戊巴比妥腹腔麻醉,氣管

12、插管,呼吸機(jī)正壓輔助呼吸；開(kāi)胸暴露心臟,以4-0無(wú)損傷線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,造成左室前壁心肌梗死模型。 2.4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植 2組大鼠于左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后1,直視下在梗死心肌周圍用微量注射器分4點(diǎn)植入標(biāo)記5-BrdU的MSCs(5106個(gè)細(xì)胞/100L),每點(diǎn)25L。關(guān)胸,維持輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù),送回籠中飼養(yǎng)。 2.5超聲心動(dòng)圖 移植后3h及移植后4周,乙醚麻醉大鼠后固定,左側(cè)胸部剃毛,經(jīng)胸應(yīng)用HP5500超聲診斷儀,探頭頻率12MHz。取乳頭肌水平左室短軸切面,分別于左室收縮末期(LVES)和左室舒張末期(LVED)在二維圖像上測(cè)量左室舒張末期前后徑(LVEDD)、左室收縮末

13、期前后徑(LVESD)、收縮末期室壁厚度(WTS)、舒張末期室壁厚度(WTD)、前壁室壁增厚率(AWTF)、后壁室壁增厚率(PWTF)。所有數(shù)值均由連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量數(shù)據(jù)平均得出。根據(jù)測(cè)值計(jì)算左室短軸縮短率(FS)及室壁增厚率(WTF)。FS(%)(LVEDDLVESD)/LVEDD100；WTF(%)(WTS-WTD)/WTD100。 2.6心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 于移植后4周股靜脈注射10%KCl處死大鼠,使心臟停于舒張期,開(kāi)胸取出心臟,PBS經(jīng)主動(dòng)脈灌注沖洗,立即行冰凍切片,丙酮固定,用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法標(biāo)記凋亡細(xì)胞核,具體操作同試劑盒說(shuō)明,DAB顯色。

14、每個(gè)切片于光鏡下200倍放大,隨機(jī)選取5個(gè)視野,檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性核占總細(xì)胞核的百分比)作為細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptoticindex,AI)。免費(fèi)論文下載中心 2.7缺血區(qū)微血管密度檢測(cè) 冰凍切片PBS沖洗兩遍,加入150抗CD31小鼠單抗,置于濕盒中4過(guò)夜,PBS洗滌后加150FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,37孵育50min,洗片后用伊文氏蘭復(fù)染,50%緩沖甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察CD31陽(yáng)性細(xì)胞,CD31陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈綠色,毛細(xì)血管密度以每高倍鏡視野(400)CD31陽(yáng)性數(shù)表示,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野。 2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用xs表示,采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

15、,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3結(jié)果 3.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞變化 接種后的細(xì)胞24h可見(jiàn)較多圓形細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中,48h可見(jiàn)貼壁細(xì)胞,較懸浮細(xì)胞體積大,大小較均一,核大多為圓形,位于細(xì)胞中央。89d后,部分細(xì)胞成梭形,個(gè)別成三角形。換液后57d基本融合鋪滿,至第3代,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形集落樣分布,形態(tài)較均一。 3.22組大鼠心功能改變 2組大鼠造模后心電圖均出現(xiàn)T波高尖改變,聯(lián)合組有1只大鼠死于造模后的室顫,其余大鼠均存活。2組大鼠在移植后3h檢查M型心臟超聲均顯示：前壁運(yùn)動(dòng)幅基本消失。移植后4周聯(lián)合移植組M型心臟超聲顯示：左室前后壁運(yùn)動(dòng)幅度正常,運(yùn)動(dòng)時(shí)相基本一致。單純移植組4周后M型心臟超聲顯示：

16、前壁運(yùn)動(dòng)幅度基本正常,但其運(yùn)動(dòng)時(shí)相較正常后壁明顯延遲。2組移植后3h和移植后4周心功能檢測(cè)值比較見(jiàn)表1。表12組大鼠移植后3h及移植后4周心功能檢測(cè)值比較(略)注：與移植后3h比較,P0.05；與單純移植組比較,P0.05。3.32組大鼠移植后4周心肌細(xì)胞凋亡比較 TUNNEL染色結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞胞核呈棕黃色,聯(lián)合移植組心肌缺血區(qū)心肌細(xì)胞AI為17.235.46,較MSCs單純移植組AI(24.979.68)明顯下降(P0.05)。 3.42組大鼠移植后4周心肌缺血區(qū)微血管密度檢測(cè) 400倍視野下,聯(lián)合移植組微血管密度即CD31陽(yáng)性細(xì)胞24320.3,較單純移植組19712.6明顯增加(P0.

17、05)。 4討論 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)冠脈或心肌局部注射將MSCs導(dǎo)入心肌缺血的微環(huán)境中,可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC),促進(jìn)局部血管新生,達(dá)到改善心肌缺血目的,從而成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。新生血管的形成可降低梗死灶周邊肥大心肌細(xì)胞的凋亡,挽救有活力的心肌細(xì)胞,減少膠原沉著,改善心功能2。但由于MSCs在體內(nèi)缺血微環(huán)境中的分化效率有限,因此,是否存在一種方法可以提高M(jìn)SCs的分化效率,增加血管新生,提高療效呢？本實(shí)驗(yàn)旨在觀察和探討應(yīng)用芪丹通脈片聯(lián)合MSCs移植可否促進(jìn)MSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,從而提高局部MVD,改善心功能,降低心肌細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)MSCs移植后4周,急性心肌梗死大鼠的心功能較移植后3h明顯改善,而芪丹通脈片聯(lián)合移植組心功能改善更為明顯,且聯(lián)合移植組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較單純移植組明顯降低,MVD明顯增加。表明芪丹通脈片具有協(xié)助MSCs移植治療急性心肌梗死、提高局部微血管密度、改善心功能、減少心肌細(xì)胞凋亡的作用,可望為臨床協(xié)助MSs移植增加療效提供一種安全、有效的治療手段。 【參考文獻(xiàn)】1FukudaK.Developmentofregenerativecard