微生物檢查法2612

1、2.6.12非無菌產(chǎn)品的微生物限度檢查：微生物計數(shù)試驗1. 簡介： 該法所描述的是在需氧條件下生長的嗜溫性細菌和真菌類微生物的定量檢測。 設計該試驗的最初目的是為了確定一種物質(zhì)或制劑是否符合微生物質(zhì)量的既定標準。如果是這種目的，則需要遵從下面的說明，包括所需樣品數(shù)，從而根據(jù)下面所提到的方法來進行結果解釋。 該法不適用于包含微生物作為活性成分的產(chǎn)品。 如果與藥典的等效性作了相關說明，可以使用自動收集法作為替代法。 2. 一般步驟 設計方法時所用條件要避免外在微生物對待測產(chǎn)品的污染。必須釆取措施，使其不影響任何待測微生物。 如果待測產(chǎn)品有抗菌活性，必須將這種活性去除或中和掉。如果因此使用了滅活劑，

2、必須證明它們對微生物的高效性和無毒性。 如果在樣品制備中加了表面活性劑，必須證明它們對微生物的無毒性和與滅活劑的兼容性。 3. 計數(shù)方法 按規(guī)定用微孔濾膜法或平板計數(shù)法。MPN法對微生物測定來說是最不精確的方法，但如果某些產(chǎn)品所含微生物的量極少，則該法是最合適的。 方法選擇基于下列因素：如產(chǎn)品的特性和所要求的微生物限量。所選方法必須能夠測定充足的樣品從而來判斷其是否符合標準。所選方法的適用性必須建立。 4. 促生長實驗、計數(shù)法的適用性和陰性對照 4-1 總則 該試驗檢測產(chǎn)品中微生物的檢測能力必須被驗證。 如果測試條件改變或產(chǎn)品改變，必須證實方法的適適用性，因為這些改變可能影響試驗的最終結果。4

3、-2 試驗菌株的準備 使用測試菌株標準穩(wěn)定的懸浮液或按下面方法制備。使用批菌種培養(yǎng)技術（seed-lot systems）使得用于接種的微生物從最初的主批種子傳代不多于5次。細菌和真菌試驗株的生長分別見表2.6.12-2。 使用氯化鈉蛋白胨（pH 7.0）緩沖液或pH 7.2的磷酸緩沖液制作試驗用懸浮液。對于黑曲霉菌需要加入0.05聚山梨醇酯80到緩沖液中。在兩小時內(nèi)使用該菌懸液或2-8下可保存24小時。作為一種可替代的制備方法，稀釋含有黑曲霉菌或枯草芽孢桿菌的新鮮懸浮液，該懸浮液中加有營養(yǎng)細胞，從而可以制得一種穩(wěn)定的孢子懸浮液，對于接種試驗來說需要將該孢子懸浮液調(diào)整到一個合適的體積下。該孢子

4、懸浮液可以在2-8保存至已經(jīng)驗證的期限。 4-3 陰性對照 為了驗證試驗條件，必須使用特定的稀釋液作為陰性對照來替代測試液。在該陰性對照品中必須沒有微生物生長。 按“5”項的方法檢測樣品時，同樣需要對照組。如果陰性對照試驗失敗的話需要分析原因。 4-4 促生長培養(yǎng)基 測試每一批準備好的培養(yǎng)基，每一批培養(yǎng)基，要么為脫水培養(yǎng)基要么含有所述成分。 用表2.6.12-1中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接種到含有大豆蛋白胨消化肉湯的液體/平板和大豆蛋白胨消化瓊脂上，對每一種使用各自的含有培養(yǎng)基的液體/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接種到沙氏葡萄糖瓊脂平板，

5、對每一種微生物使用含各自培養(yǎng)基的平板。接種條件見表2.6.12-1。 對固體培養(yǎng)基而言，以標準接種物來說，所得的生長值不超過計算值的兩倍。與用先前的測試方法和驗證的批培養(yǎng)基所得的測試結果相比，新制備的接種物將會出現(xiàn)微生物的生長值。與用先前的測試方法和驗證的批培養(yǎng)基所得的測試結果相比，如果微生物生長清淅可見，則液體培養(yǎng)基是合適的。表2.6.12-1微生物制備和使用微生物受試菌株制備促生長在產(chǎn)品存在的情況下的計數(shù)方法的適應性需氧菌總數(shù)總酵母菌和霉菌數(shù)需氧菌總數(shù)總酵母菌和霉菌數(shù)金黃色葡萄球菌如： ATCC6538 NCIMB9518 CIP4.83 NBRC13276 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆

6、消化肉湯 30-35 18-24小時 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉 湯 100CFU 30-35 3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯 100CFU 30-35 3天銅綠假單胞菌如： ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC13275 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯 30-35 18-24小時 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉 湯 100CFU 30-35 3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯 100CFU 30-35 3天枯草桿菌 如： ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC 3134

7、酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯 30-35 18-24小時 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉 湯 100CFU 30-35 3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯 100CFU 30-35 3天白色念珠菌 如： ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48.72 NBRC 1594沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯 20-25 2-3天 酪蛋白大豆消化瓊脂 100CFU 30-35 5天沙氏葡萄糖瓊脂 100CFU 20-25 5天 酪蛋白大豆消化 瓊脂 100CFU 30-35 5天 MPN： 不能適用沙氏葡萄糖 瓊脂 100CFU 20-25 5天 黑曲霉菌 如：

8、 ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡糖萄糖瓊脂 20-25 5-7天或能達到有很好的芽孢形成 酪蛋白大豆消化瓊脂 100CFU 30-35 5天沙氏葡萄糖瓊脂 100CFU 20-25 5天 酪蛋白大豆消化 瓊脂 100CFU 30-35 5天 MPN： 不能適用沙氏葡萄糖 瓊脂 100CFU 20-25 5天 4-5對于待測產(chǎn)品合適的計數(shù)方法 4-5-1 樣品制備 ：樣品制備方法選擇依賴于待測產(chǎn)品的物理特性。如果下述方法均不合適的話，可選用替代方法。水溶性產(chǎn)品：溶解或稀釋（通常1：10的稀釋液）待測產(chǎn)品于氯化鈉蛋白胨（

9、pH 7.0）緩沖液, pH7.2 的磷酸緩沖液或酪蛋白大豆消化肉湯。如有必要，調(diào)節(jié)pH 6-8。如果必要可用相同稀釋液進一步稀釋。 不溶于水的非脂類產(chǎn)品：使待測物（通常以1：10稀釋制備）懸浮在pH7.0 的緩沖氯化鈉蛋白胨 溶液，pH7.2 的磷酸緩沖液或酪蛋白大豆消化肉湯中。加入如1g/l的聚山梨醇酯80表面活性劑使幾乎能潤濕的物質(zhì)懸浮。如有需要，調(diào)節(jié)pH為6-8。如果必要可用相同稀釋液進一步稀釋 脂類產(chǎn)品：將受檢產(chǎn)品溶解在豆蔻酸異丙脂中，通過過濾或把產(chǎn)品與最小需要量的無菌聚山梨醇 酯80或與其他的非抑制表面活性劑混合進行滅菌，如果需要，加熱到不超過40，或者在特殊情況下不超過45。仔細

10、混合且如有必要在水浴中保溫。加足量預熱的所選稀釋液來制備原產(chǎn)品的1：10的稀釋溶液。仔細混合同時在所需的最短時間內(nèi)保溫來形成乳狀液?？梢允褂煤泻线m濃度的無菌聚山梨醇酯80或其它的非抑制無菌表面活性劑來制備一系列的十倍稀釋液。 液體或固體的氣溶膠：將產(chǎn)品在無菌條件下轉(zhuǎn)移到一個膜過濾裝置或者一個無菌容器中來進一步 取樣?；蚴褂每偤炕蚴褂妹總€容器劑量確定的量。 透皮貼劑。去掉透皮貼劑的保護層(“隔離襯墊”)并把它們向上貼在無菌玻璃或塑料盤上。 用無菌多孔物質(zhì)例如無菌紗布來覆蓋粘貼面，避免透皮貼劑粘在一起并把透皮貼劑轉(zhuǎn)移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的滅活劑的所選適當體積的稀釋液中。至少用力振

11、搖制備溶液30分鐘。 4-5-2 接種和稀釋：加上述制備的樣品（4-5-1）到一個控制的（不含待測物質(zhì)）足夠量的微生物混懸溶液中來獲得一個不超過100CFU的接種液。接種液的體積不能超過稀釋產(chǎn)品的體積的1%。 為說明產(chǎn)品的可接受微生物回收率，實驗中應該使用制備樣品的最低可能稀釋因子。如果因為抗微生物活性或者差的溶解性而不可能做到，需要進一步探索合適的方案。如果樣品的生長抑制不可避免，在中和、稀釋或過濾后可加入微生物混懸液。 4-5-3 中和/去除抗微生物活性 把根據(jù)4-5-2所述稀釋制備的樣品和按照4-5-4中所述步驟培養(yǎng)的微生物數(shù)和與對照制備中回收的微生物數(shù)作比較。 如果生長被抑制（抑制因子

12、大于2），修改計數(shù)測試的方法來保證結果的有效性。修改可能包括，如，（1） 稀釋液或培養(yǎng)基體積的增加，（2）特殊的或一般的中和劑與稀釋液的結合，（3）膜過濾，或（4） 上述措施的組合。 中和劑： 中和劑可被用來中和抗菌劑的活性（表2.6.12.-2）?？稍跍缇凹尤氲剿x稀釋液或更 好的培養(yǎng)基中。如果使用的話，它們的功效和對微生物無毒性必須通過使用中和劑而不使用產(chǎn)品的空白實驗進行說明。 干擾物質(zhì) 可能的中和方法戊二醛，汞硫酸氫鈉（亞硫酸氫鈉）酚，醇，醛，山梨酸酯稀釋乙醛甘氨酸季銨化合物(QACs)，對羥基苯甲酸酯（對羥基 苯甲酸酯），二-二雙胍類卵磷脂QACs， 碘，對羥基苯甲酸酯聚山梨醇酯汞劑

13、硫乙醇酸鹽汞劑，鹵素，醛硫代硫酸鹽EDTA（乙二胺四乙酸鹽）Mg2+或Ca2+若沒有合適的中和方法，可認為分離接種微生物失敗歸因于產(chǎn)品自身的殺菌活性。這說明產(chǎn)品不可能被上述微生物污染。然而，產(chǎn)品可能只對其中一些有抑制作用，而對其他一些測試菌株沒有作用或菌株沒有代表性。然后，以微生物生長和標準所允許的最高濃度系數(shù)進行試驗。 4-5-4. 產(chǎn)品存在情況下微生物的回收率 對以上列出的微生物進行單獨的試驗。僅對加入的測試菌微生物進行計數(shù)。 4-5-4-1. 膜過濾： 使用孔徑不大于0.45m的濾膜過濾。選擇濾膜材料類型時，要求濾膜對微生物的滯留能力不受到待測樣品成份的影響。每種上述微生物使用一張濾膜。

14、 將適量按4-5-1至4-5-3制備的樣品（含1g產(chǎn)品，若預期CFU較大，則小于1g）用膜過濾，立即過濾并用適量稀釋液沖洗濾膜。 將膜轉(zhuǎn)移到酪蛋白大豆消化瓊脂表面上，以確定厭氧菌總數(shù)(TAMC)。將濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上，以確定總酵母菌/霉菌數(shù)（TYMC）。按表2.6.12-2接種，進行計數(shù)。 4-5-4-2. 平板計數(shù)法：至少在對各培養(yǎng)基使用兩次平板計數(shù)法，對結果取平均值。 4-5-4-2-1. 傾注培養(yǎng)法 在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，加入1ml按4-5-1至4-5-3法制備的樣品以及15-20ml酪蛋白大豆消化瓊脂或沙氏葡糖瓊脂。培養(yǎng)基溫度均不超過45。若使用更大的培養(yǎng)皿，則瓊脂的量也要相應

15、增加。對于表2.6.12.-2中列出的每種微生物，至少要使用2個培養(yǎng)皿。根據(jù)表2.6.12.-2進行培養(yǎng)。取各培養(yǎng)基的菌落數(shù)的算術平均值計算原接種物的CFU。 4-5-4-2-2. 表面涂布法 在各直徑9cm的培養(yǎng)皿中加入15-20ml酪氨酸大豆消化瓊脂或沙氏葡糖瓊脂，放置使其凝固。培養(yǎng)基溫度均不超過45。若使用更大的培養(yǎng)皿，則瓊脂的量也要相應增加。在層流通風柜或培養(yǎng)箱中干燥。對于表2.6.12.-2中列出的每種微生物，至少要使用2個培養(yǎng)皿。量取不少于0.1ml按4-5-1至4-5-3制備的樣品涂布于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)并按4-5-4-2-1描述的方法計數(shù)。 4-5-4-3最大概率數(shù)法（MPN）

16、MPN法的精密度和準確度不及膜過濾法和平板計數(shù)法。對霉菌計數(shù)的結果尤為不可靠。因此，在其他方法不可行時，才可以考慮使用MPN法對TAMC計數(shù)。如果認定該法可用，則按以下方法進行。 按4-5-1至4-5-3制備至少3個系列10倍產(chǎn)品稀釋液。對于每個濃度梯度的溶液，將3等分試樣接種于含9-10ml酪蛋白大豆消化培養(yǎng)基的試管內(nèi)。若有必要，應向培養(yǎng)基中加入表面活性試劑，例如山梨酸酯80，或微生物抑制劑。這樣，若使用3個梯度的稀釋度，則共接種9個試管。 在30-35培養(yǎng)不超過3天。若因產(chǎn)品本身的性質(zhì)難以讀出結果或不能確定，則在同一培養(yǎng)基或酪蛋白大豆消化瓊脂上在同一溫度下傳代培養(yǎng)1-2天，得到的結果。根據(jù)

17、表2.6.12.-4確定每克或每毫升產(chǎn)品微生物最大概率數(shù)。 4-6. 結果和解釋 在確定膜過濾法和平板計數(shù)法的適用性時，任意試驗菌平均數(shù)與4-5-2中無產(chǎn)品存在的對照值相差不大于2。在確定MPN法適用性時，接種值的計算值與對照值必須在95置信區(qū)間內(nèi)。 若不符合上述標準或試驗菌大于以上方法所述，則使用最接近標準的方法和試驗條件。 5. 產(chǎn)品試驗 5-1.試驗使用量 除另有規(guī)定外，參照上述方法取10g或10ml待測品。液體或固體的氣溶膠，取10個容器的樣品。若為透皮貼劑，取10片。 活性物質(zhì)按以下方式制備的情況下，試驗用量可以減少：單位劑量（如片劑，膠囊和注射劑）少于或等于1mg，或每克或每毫升（

18、對于不以單位劑量為形式的制劑）中活性物質(zhì)少于1mg。在這些情況下，試驗用量不少于產(chǎn)品的10個單位劑量或10g或10ml。 對于作為活性物質(zhì)的原料，若樣品的量受限制，或批量很小（如：少于1000ml或1000g），則試驗量應為批量的1，除非另有規(guī)定允許使用更小的量。 對于批量總數(shù)小于200（如臨床試驗使用的樣品），則樣品可減少為2個單位，若批量小于100，可為1個單位。 從原料藥或包裝的制劑中隨機取樣。混合一定量包裝中的產(chǎn)品，以便得到足量樣品。5-2. 產(chǎn)品試驗 5-2-1. 膜過濾 使用規(guī)定的過濾裝置過濾培養(yǎng)基。根據(jù)第4節(jié)中所述適用的方法制備樣品，并將適量樣品各轉(zhuǎn)移到2張膜上，并立即過濾。選取

19、以下合適的方法沖洗各膜。 將膜轉(zhuǎn)移到酪蛋白大豆消化瓊脂表面上，以確定厭氧菌總數(shù)(TAMC)。將濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上，以確定總酵母菌/霉菌（TYMC）。接種于酪蛋白大豆消化瓊脂上，在30-35下培養(yǎng)3-5天，接種于沙氏葡糖瓊脂上，在20-25下培養(yǎng)5-7天。計算每克或每毫升產(chǎn)品的CFU。 對于透皮貼劑，根據(jù)4-5-1所述，各通過2張無菌膜分別過濾制劑體積的10。將一張膜轉(zhuǎn)移至酪蛋白大豆消化瓊脂上確定TAMC，另一張轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上確定TYMC。 5-2-2.平板計數(shù)法 5-2-2-1. 傾注培養(yǎng)法 根據(jù)第4節(jié)所述制備樣品。每一培養(yǎng)基的每種稀釋度至少制備2個培養(yǎng)皿。接種于酪蛋白大豆消化瓊脂

20、上的，在30-35下培養(yǎng)3-5天；接種于沙氏葡糖瓊脂上的，在20-25下 培養(yǎng)5-7天。根據(jù)上述稀釋度選取相應培養(yǎng)皿， TAMC的最大菌落數(shù)不少于250個，TYMC最大菌落數(shù)不少于50個。取各培養(yǎng)基的菌落數(shù)的算術平均值，計算每克或每毫升產(chǎn)品的CFU。 觀察到的各試管菌數(shù)每克或每毫升產(chǎn)品的MPN95%置信區(qū)間各試管種產(chǎn)品的克數(shù)或毫升數(shù)0.10.010.001000< 30-9.400130.1-9.501030.1-100116.11.2-170206.21.2-170309.43.5-351003.60.2-171017.21.2-17102114-351107.41.3-20111114-35120114-35121155-38130165-382009.21.5-35201144-35202205-38210154-38211205-38212279-94220215-40221289-94222359-94230299-94231369-94300235-94301389-1043026416-18