生理試驗方法

1、試 驗 方 法 王濤1.SOD（超氧化物歧化酶）：氮藍四唑法（NBT）法稱0.5g鮮樣，加1ml磷酸緩沖液（0.05mol/L，PH7.8），冰浴研磨，研磨后再加1.5ml緩沖液，倒入離心管中，再用2.5ml緩沖液清洗研缽，倒入離心管中，平衡，低溫（04）離心20min（10500rpm），離心后冷藏保存。取型號相同的試管，試管中加50L上清液(2支對照試管中各加磷酸緩沖液50L)，分別加3ml反應液，其中1支對照試管置于暗處，其余各管于4000lx日光下反應2030 min（要求各管受光情況一致，溫度高，時間縮短，低時延長）。反應結束后，以不照光的對照管作空白，于560nm下比色測定吸光度值

2、。·磷酸緩沖液配制法：A：（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g，蒸餾水定容至1000mlB：（0.2mol/L NaH2PO4溶液）：NaH2PO4·H2O 27.6g或NaH2PO4·2H2O31.21g，蒸餾水定容至1000ml0.1mol/L緩沖液配法A：x（ml）+B：y（ml）稀釋至200ml；0.05mol/L稀釋至400ml。 0.1 mol/Lx(ml)y(ml)PH0.05mol/Lx(ml)y(ml

3、)PH12.387.76.061.039.07.084.016.07.591.58.57.891.58.57.894.75.38.0·反應液：水：磷緩：Met：NBT：EDTA-Na2：FD（核黃素）5：30：6：6：6：6150ml反應液組成：水12.7ml+磷緩76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA-Na215.25ml+FD15.25ml 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：1.9399gMet用磷緩定容至100ml；750mol/L氮藍四唑溶液：0.06133gNBT用磷緩定容至100ml，避光保存；100mol/L EDTANa2溶液：0.

4、03721g EDTANa2用磷緩定容至1000ml；20mol/L核黃素溶液：0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml，避光保存。·計算公式：以抑制NBT光化學還原50%所需酶量為酶活性單位(U)SOD總活性（units·g-1FW）(（Ack-AE）*V)/(0.5*Ack*W*Vt)SOD比活力(units·mg-1Pr)= SOD總活性/蛋白質含量Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（4ml），ml；Vt為測定時樣品用量，ml；W為測定時樣品重量（0.5g）；蛋白質含量單位為mg/gFW。2.POD(過氧化物酶)：愈創(chuàng)木

5、酚法取上清液20L加入比色杯中（對照加20L磷緩），加3ml反應液，馬上讀470nm下的OD值并計時，每隔1min讀一次（讀0、1、2、3min的OD值）。·反應液：0.1mol/L，PH6.0的磷緩50ml，加入愈創(chuàng)木酚28L，于磁力攪拌器上加熱溶解，加入30H2O219L存于冰箱中。·計算公式：POD總活性(OD470·min-1·g-1FW)（OD470*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.02ml;W=0.5g；t1min) POD比活力（OD470·min-1·g-1Pr）總活性/蛋白質濃度3.CAT（過氧化氫酶）：取

6、上清液100L加入比色杯中（對照加100L磷緩），加3ml反應液，馬上讀240nm下的OD值并計時，每隔1min讀一次（讀0、1、2、3min的OD值）。·反應液：0.1mol/L，PH7.0磷緩20ml，加0.1mol/L H2O25ml（5.68ml，30H2O2定容至1000ml）。·計算公式：CAT總活性(OD240·min-1·g-1FW)（OD240*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) CAT比活力（OD240·min-1·g-1Pr）總活性/蛋白質濃度4.MDA（丙二醛）：取上清液1ml（對

7、照加1ml水），加2ml0.67TBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷卻（用冷水沖泡），倒入指形管中，4000rpm下離心20min，取上清液于600nm、532nm、450nm下比色。·0.67TBA：稱0.67gTBA，加少量1mol/LNaOH溶液，再用10三氯乙酸定容至100ml。·計算公式：C MDA（mol/L）6.45（A532A 600）0.56A450（消除糖類物質的干擾作用）MDA (mol/gFW)=C*V/W=0.1548(A532A 600)0.01344 A450(V=0.012L;W=0.5g)5.可溶性蛋白：考馬斯亮蘭G-250

8、染色法取上清液20L（對照加20L水），加3ml考馬斯亮蘭，放置2min后，馬上于595nm下比色。G-250：100mg溶于50ml，90的乙醇中，加入85（w/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常溫下可放置一個月。標準曲線：Ypro（g）143.45OD+3.6（生）或143.56OD+1.28（園） 蛋白質含量（mg/gFW）（3*Y*V）/5*1000*a*W（Y標線值g；V酶液總體積4ml；a0.02ml；W0.5g；3/5由于標線是5ml中的含量，而本試驗為3ml；1000將g變mg）6.ASP（抗壞血酸過氧化物酶）：抗壞血酸過氧化物酶（APX）：0.2ml酶提取液+2.8m

9、lAPX反應液，290nm比色（10S/20S）。（E=2.8 mMcm-1）APX反應液：55 l 30% H2O2（1mM）+0.02359g ASA（0.25mM）+0.01994gEDTA-Na2（0.1mM），磷酸緩沖液（pH7.0）定容至500ml。取1.0g樣品，加1ml提取液（磷酸緩沖液0.05mol/L，PH7.8；2mmol/LAsA；5mmol/LEDTA，現(xiàn)用現(xiàn)配），冰浴研磨，研磨后再加1ml提取液，倒入離心管中，再用2ml提取液清洗研缽，倒入離心管中，平衡，低溫（04）離心20min（10000rpm）。取上清液100L加入比色杯中（對照加100L提取液），加3ml反

10、應液，馬上讀290nm下的OD值并計時，每隔1min讀一次（讀0、1、2、3min的OD值）。·反應液：50mmol/L磷緩，PH7.0；0.1mmol/LEDTA；0.1mmol/L H2O2，0.5 mmol/LAsA。·計算公式：ASP總活性(OD290·min-1·g-1FW)（OD290*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=1.0g) ASP比活力（OD290·min-1·g-1Pr）總活性/蛋白質濃度7脯氨酸：0.5g鮮樣（或0.05g干樣），加5ml磺基水楊酸，封口沸水浴10min，冷卻，用濾紙漏斗過濾

11、，吸濾液2ml（對照吸蒸餾水2ml），加2ml冰乙酸，再加3ml酸性水合茚三酮顯色液，沸水浴40min，冷卻，加5ml甲苯，充分震蕩，靜置分層，取上層甲苯液于520nm下比色。·3%磺基水楊酸：6g定容至200ml；·2.5%酸性茚三酮顯色液：（150ml用量）3.75g茚三酮+90ml冰乙酸+24ml磷酸+36ml蒸餾水（4下23日有效）·標準曲線：Y脯氨酸=21.594OD-0.0785·計算公式：脯氨酸（g/gFW或DW）=Y*V/a*W(Y由曲線查得；V提取液體積=5ml；a為測定時吸取的體積=2ml；W為樣品重=0.5g)8.電導率：鮮樣先用自

12、來水沖洗，再用蒸餾水沖洗2次，用打孔器打取圓片，取0.5g，裝入大試管中，加入20ml蒸餾水，抽氣3次，每次20min，第一次抽氣后取出搖動，室溫保持34h，多次搖動，測電導率S1，封口沸水浴10min，冷卻（可用冷水沖泡），平衡10min后測S2，同時測定蒸餾水S0。·計算公式：相對電導率（%）=100*（S1S0）/（S2S0）9.根系活力：根系去掉根尖和上部老根，取根0.40.5g，剪成2cm長的段，放入試管中，對照先加2ml，1mol/L的H2SO4，其余試管中加0.4%TTC和磷緩（1/15mol/L，PH7.0）等體積混合10ml，封口，放入37恒溫箱中4h，取出，除對照

13、外，其余加2ml，1mol/L的H2SO4終止反應，放置15min后，取出根，吸干，再放回原試管，各試管中加10ml，95%乙醇，封口，提取24h至根變白，根據顏色稀釋35倍后，于485nm下比色。·0.4%TTC：稱TTC1g，溶于250ml水中。·1/15mol/L，PH7.0的緩沖液：A61ml+B39ml，稀釋至300ml·1mol/L的H2SO4：先在燒杯中加約100ml水，再加濃硫酸11ml，冷卻后定容至200ml。·計算公式：四氮唑還原強度（g/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022(h=4,W=0.40.5)10.

14、葉綠素稱取葉片0.2g，加20ml，80的丙酮（80ml丙酮定容至100ml），封口，置于暗處2436h，至葉片發(fā)白，于663nm、646nm、470nm下比色（以80丙酮為對照）。公式：色素濃度Ca（mg/L）12.21D663-2.81D646Cb20.13 D646-5.03 D663Cx.c（1000D470-3.27Ca-104Cb）/229色素含量（mg/gFW）C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)11硝酸還原酶（活體法測定）【樣品應先照光23小時后采】稱取葉片0.5g，剪成0.5-1.0cm2小塊，加入試管中，對照先加1ml30三氯乙酸溶液，然后再向各試管中加入

15、0.1mol/l KNO3溶液9ml，抽氣1小時，置于25暗反應30min。然后向各試管中加入1ml30三氯乙酸溶液【待葉片變色后（黃）】吸上清液1ml于新試管中，加2ml 1的黃胺和2ml 0.02萘胺溶液。顯色20min，540nm下比色。（吸光值不能大于2，否則應稀釋再測）80個樣的用量：0.1 mol/l，PH7.5的磷緩：A液420B液80水500，將KNO3 10.11 g溶于上述1000 ml磷緩中。1黃胺：稱2.5克溶于62.5 ml濃HCL中，定容至250 ml。0.02N1萘乙二胺酸鹽：稱0.06克于300 ml水中。30三氯乙酸：稱30克溶于100 ml水中。標準曲線：Y

16、 NO2 =8.7317OD-0.4178計算公式：NR 活性（NaNO2 ug/gFW.h）=Y .n/W. h ( n=10/2,h=0.5)12.自由水/束縛水含量測定取稱量瓶n（每處理6個，3次重復）個，編號，分別稱準重量，用0.5cm2左右的打孔器打取300片，分別隨機放入稱量瓶中（各50片），蓋緊，準確稱取各瓶重量，求出各瓶樣品鮮重，將其中3瓶置烘箱中于105下10min殺死組織，再于80下烘至恒重，求出組織含水量（%）。將另外3個稱量瓶各加入60%65%（重量百分濃度）蔗糖溶液5ml，再準確稱量求出各瓶糖液重量，于暗處放置46 h，其間不時輕輕搖動。到預定時間后充分搖動，用折射儀

17、分別測定各瓶糖液濃度，同時測定原來的糖液濃度。·60%65%蔗糖溶液：6065g蔗糖，置燒杯中加蒸餾水4035g，使總重量為100g。·計算公式：自由水含量（%）=100*(G*(D1D2)/D2)/W(G為糖含量g；D1糖液原來濃度%；D2浸葉后糖液濃度%；W植物組織鮮重g)束縛水含量（%）=組織含水量（%）自由水量（%）13.GR谷胱甘肽還原酶:（基于NADPH的氧化作用而在340nm下吸光度減少來衡量）鮮樣0.5g，加入4ml50mmol/L的Tris-HCl（7.0），內含20（V/V）甘油，1mmol/LAsA，1mmol/LDTT，1mmol/LEDTA, 1m

18、mol/LGSH及5mmol/LMgCl2，在冰上研磨后，提取液在4下，經過20000×g離心30min，上清液用來測定酶活性。取上清液100L加入比色杯中（對照加100LTris-HCl），加3ml反應液，馬上讀340nm下的OD值并計時，每隔1min讀一次（讀0、1、2、3min的OD值）。·反應液：50mmol/L的Tris-HCl（PH7.5），5mmol/LMgCl2，0.5mmol/LGSSG，0.2mmol/LNADPH，終體積為1.2ml·計算公式：GR總活性(OD290·min-1·g-1FW)（OD340*V）/(a*W*t

19、)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) GR比活力（OD340·min-1·g-1Pr）總活性/蛋白質濃度14.O2-超氧陰離子自由基：羥胺氧化法(王愛國等1990)稱2g樣品加3mL提取液研磨提取后,吸2mL提取液供測定,反應時間為20min,求每克鮮樣每分鐘產生O-2的速率.以上指標測定均重復3次.藥品：磷酸緩沖液、Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4·H2O、Met、NBT、EDTA-Na2、FD、愈創(chuàng)木酚、30H2O2、TBA、NaOH、10三氯乙酸、考馬斯亮蘭、90的乙醇、85（w/v）磷酸、AsA、磺基水楊酸、冰乙酸、甲苯、茚三酮

20、、蒽酮、乙酸乙酯、H2SO4、TTC、蔗糖、甘油、DTT、GSH、 MgCl2、Tris-HCl、GSSG、NADPH15. 可溶性糖：蒽酮比色法0.3g鮮樣加10ml蒸餾水，封口沸水浴30min，（2次），濾紙漏斗過濾入50ml容量瓶中，沖洗殘渣，定容。吸提取液1ml，加蒸餾水1ml（對照加2ml蒸餾水），加蒽酮乙酸乙酯液0.5ml，加濃H2SO45ml，振蕩，沸水浴1min，自然冷卻，于630nm下比色。·蒽酮乙酸乙酯：稱1g蒽酮溶于50ml乙酸乙酯中（貯于棕色瓶中，可放數星期，如有結晶，加熱溶解）·標準曲線：Y糖(g)=322.58OD0.96774·計算公

21、式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106)(Y為標線糖量g；V提取液體積=50ml；a為測定時吸取的體積=1ml；n稀釋倍數=6.5，W為樣品重=0.3g)16 苯丙氨酸解氨酶（PAL)（1）酶液提取方法。參照李靖等的方法準確稱取0.5g鮮樣，液氮保存后放入低溫冰箱存樣。取樣后加入5mlpH8.8的硼酸緩沖液（含有5mmol/L巰基乙醇和0.01g聚乙烯吡咯烷酮），冰浴中研磨，0-4下8000r/min離心15 min，。上清液用于測定PAL活性。（2）PAL活性測定方法。參照毛愛軍等的方法反應液為1ml pH8.8 1硼酸緩沖液（含0.02mol/l的L -苯丙氨酸），加入1

22、 ml酶液，2ml蒸餾水，總體積為4ml。對照不加酶液，以1ml蒸餾水代替。反應液置恒溫水浴30下反應30min，加0.2 ml6mol/L HCl終止反應，測290 nm波長下吸光值，以反應時間零作參比，以OD290變化0.01為一個酶活性單位（U），用U/(gFW·h)表示酶活性。PAL活性（OD290nmmin-1g-1.FW）=OD290nm×N/W×T×nN:酶液提取總體積ml W：樣品鮮重g T：反應時間min n：反應體系中酶液體積ml pH8.8的硼酸緩沖液：取60ml溶液A和40ml溶液B用水稀釋至200ml溶液A：0.2mol/L硼酸

23、（12.4g硼酸H3BO3用蒸餾水配成1000ml）溶液B：0.05mol/L硼砂（19.07g硼砂Na2B4O7.10H2O用蒸餾水配成1000ml）0.02mol/L苯丙氨酸硼酸緩沖液：每毫升pH8.8的硼酸緩沖液加0.0033038g L-苯丙氨酸17多酚氧化酶(PPO)藥品 檸檬酸、磷酸氫二鈉,鄰苯二酚(兒茶酚)。所用藥品均為國產分析純。實驗儀器 超低溫冷凍冰箱,美國貝克曼公司(Backman.U.S.A.);電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;低速冷凍離心機(DL-5LM),湖南星科科學儀器有限公司;微量移液器(5005000l,1001000l),made in Germany

24、;紫外分光光度計2010型,日本日立公司。實驗方法2.2.1待測酶液制備分別稱取以上刺嫩芽樣品各1g加入10ml pH 5.6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液于冰水浴中快速研磨成勻漿,離心20min (44000r/min ),取上清夜即酶液,貯存于冰箱(4)中待測。2.2.2酶活力測定方法17在反應體系中加入0.5ml pH5.6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液和1 ml 0.2mol/L鄰苯二酚溶液作為底物倒入1cm比色杯中混勻,加入0.5 ml刺嫩芽待測酶液,迅速放入紫外分光光度計中于420 nm處進行時間掃描(以pH5.6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液為空白),反應時間為4 min,每30s記錄吸光度

25、值(OD值)。計算每分鐘的OD值變化,即OD420nm。酶活力單位定義為:在一定溫度、pH值條件下1mmol/L底物濃度每分鐘改變0.01吸光度所需的酶量為1個酶活力單位。計算公式:多酚氧化酶活性:u/(g·min)=420×V/W×V×0.01×t其中,VT提取酶液總體積,10ml;W待測材料質量,1g;Vs測定時取用酶液體積, 0. 5ml;t反應時間變化,4min;D稀釋倍數,4。求出酶活力的平均值,并利用公式計算出標準誤差(SE):=(N1-N)2+(N2-N)2+(N3-N)22(N算術平均值;N1第1組樣品的酶活力單位數;N2第2組

26、樣品的酶活力單位數;N3第3組樣品的酶活力單位數)。對所得數據進行t檢驗(n<30)。利用公式t0=xS/ n其中,x為樣本的均數,為平均OD值;S為標準誤差SE;n為自由度,為1。木質素的測定參照Sancho的半定量法。精確稱取鮮重0.5g的材料于沸水中沖洗,液氮研磨后加去離子水（5ml）離心（8000g，15min，20）,以無水乙醇沖洗（2次）沉淀,將沉淀溶解（震蕩）于5.0mL4%的HCl/乙醇溶液中2.5h,期間渦旋數次（加入后渦旋，以后每1小時渦旋一次，共3次）,加入100L含3%的間苯三酚的鹽酸溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用，避光）,30min后離心（同上）取上清,測定540nm處的吸光值

27、,以不加植物材料的反應液為空白,吸光值表示木質素類物質的含量。（測出的只是相對植，注意取材要一致）17 PPO活性測定 采用高俊鳳的方法進行提取和測定 酶液的制備：每一重復準確稱取0.5g黃瓜葉片，洗凈，剪碎，放入研缽中，加入少量石英砂（加少量PVP)，然后加入5ml0.05mol/LPH6.5的磷酸緩沖液冰浴中快速研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入離心管中，在4下5000r/min離心10min。上清液定容到10ml，此為PPO粗酶液。 多酚氧化酶測定：反應體系包括0.05mol/lPH6.5的磷酸緩沖液1.5ml，0.1mol/l鄰苯二酚1.5ml和酶液0.5ml以煮沸失活的酶液作對照，于37保

28、溫10min，立即加入20%三氯乙酸溶液3ml終止反應，與525nm波長處理測定其吸光度。 A525×酶提取液總量（ml） 酶活力（0.1Ag-1min-1）                        0.1×反應時間（min）×樣品鮮重（g）×測定時酶液用量（ml） 18 總酚和單寧含量測定 參照武予清迅速用冷凍

29、干燥機在-70下24h凍干,取出粉碎,過80目篩,將凍干粉置于-20下密封保存?zhèn)溆?準確稱取樣品凍干粉20mg,放入具塞試管中,然后在試管中加入70%甲醇5ml,封口搖勻,在室溫下放置24h,然后用5000轉·min-1離心10min,取上清液備測.總酚測定：Folin酚還原法：原理是堿性溶液中酚類化合物可在以將鎢鉬酸還原,生成藍色的化合物.顏色的深淺與酚含量呈正相關, 在760nm處有最大吸收峰. 0.1mg/cm3 標準沒食子酸溶液（稱取標準沒食子酸0.01g,定容到100ml）； 吸取待測液1一2ml（0.5），放入盛有70ml（8.9ml）蒸餾水的試管中，加入5ml （0.5

30、ml）F一D試劑和10ml（0.1ml）飽和Na2CO3溶液，總體積100ml（10ml）搖勻，半小時后立刻用分光光度計在760nm處進行比色測定。測定之前應先配制F一D試劑，飽和Na2CO3榕液、1%FeCl3溶液（用來校準提取完全的）和沒食子酸標準液。F一D試劑的配制方法是:在750毫升蒸餾水中，加入鎢酸鈉100克、磷鉬酸20克及濃磷酸50毫升，加熱回流2小時，冷卻后稀釋至1000毫升。用同樣條件，按上述方法，用蒸餾水作空白試驗，以此校正儀器零點。又用同樣條件作標準0.1mg/cm3 標準沒食子酸溶液（稱取標準沒食子酸0.01g,定容到100ml）的工作曲線，標準曲線的制作：取12支干燥的

31、試管，分成2組，每組依次加入0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6cm3標準沒食子酸溶液，用蒸餾水補足1ml，另取一支試管，加1ml蒸餾水作對照。按上述方法分別加入F一D試劑及飽和Na2CO3溶液，半小時后立刻用分光光度計在760nm處進行比色測定。測定吸收值(A)，以吸收值對沒食子酸ppm數繪制工作曲線。從工作曲線土查出樣品相應的沒食子酸ppm數，依下式求出總酚含量?？偡? = T×100/W×(V1/V0) ×106 = (T×V0/W×V1)×10-4 (T一從工作曲線上查出相應的單寧酸PPm數;W一樣品克數;V。一

32、提取液定容的毫升數;V;一用于比色的提取液毫升數)單寧測定：香草醛反應：應專門用于測定縮合單寧及其前體黃烷醇(如兒茶素等),但是與氧化程度較高的黃酮(如槲皮素及其糖苷)不發(fā)生反應,是從縮合單寧與黃酮類化合物的混合物中測定縮合單寧含量的較好方法.將4%香草醛的甲醇溶液3ml、濃鹽酸1.5ml和0.5ml的待測提取液加入以鋁箔遮光的試管中搖勻,放入20的水浴鍋中水浴20min,然后在510nm處測定吸光度,標準樣品為兒茶素(Fluka).19類黃酮含量的測定方法：精確稱取烘干的樣品002g，加入5ml50乙醇浸泡12h，在一定溫度和超聲頻率下處理一定時間后趁熱過濾。取1ml提取液，加4ml30乙醇

33、，然后加入5的亞硝酸鈉0.3ml，搖勻放置5min，加10的硝酸鋁0.3ml，放置6min，加1M的氫氧化鈉4m1，再加0.4 30乙醇，共10ml。搖勻，放置10min后，以相應試劑作空白對照，在510nm下測定吸光值。標準樣品為蘆丁(中國藥品生物制品檢定所)。所確定的標準曲線：Y=14335X+00235，R2=09991，P<0001，式中，X為吸光度，Y為濃度(mg·ml-1)，線性范圍：020mg·ml-1。·黃酮含量的測定方法取烘干的樣品，用液氮將其研磨至粉末狀，精確稱取005g，加入5ml95乙醇后，在44下，超聲60min。離心10min，室

34、溫靜置4h，進行樣品提取液制備。其過程為：取25ml容量瓶，加4ml水，吸取樣品提取液2ml，加入5的亞硝酸鈉1ml，搖勻放置6min，加10的硝酸鋁1ml，放置6min，加5的氫氧化鈉l0m1，再加水定容至刻度，搖勻，放置15min后，以相應試劑作空白對照，在500nm下測定吸光值。根據標準曲線計算出提取液中黃酮的含量。標準樣品為蘆丁(中國藥品生物制品檢定所)。所確定的標準曲線：Y=14335X+00235，R=09991，P<0001，式中，為吸光度，】，為濃度(mg·ml)，線性范圍：020mg·ml。20生物堿含量的測定方法:將風干的白屈菜樣品粉碎過篩(40目

35、)，精密稱取01g樣品，加氯仿一乙醇(1：1)5ml，冷浸過夜后，用超聲波儀超聲30min，離心10min。取上清液4ml，氮氣干，加4ml95乙醇與冰醋酸混合液(10ml中有5滴冰醋酸)復溶，超聲10min。將025ml提取液定容至5m1。以相應試劑作空白對照，在350nm波長下測定吸光值。根據標準曲線計算出提取液中生物堿的含量。標準樣品為鹽酸小檗堿。所確定的標準曲線：Y=14684X一00038，R2=09998，P<0001，式中，X為吸光度，y為濃度(g·ml-1)，線性范圍：20200g·ml-1。21 CHS CHS enzyme was extracte

36、d and assayed using HPLC byfollowing the method used by Zuurbier et al.(1993).One gram of frozen stem and leaf tissues were homo-genized using a pestle and mortar in 10%(w/w)poly-vinylpolypyrrolidone(PVPP)and 5 ml 0.1 M potassiumphosphate extraction buffer(pH 6.8)containing 14 mM b-mercaptoethanol,4

37、0 mM ascorbic acid,3 mM EDTA,10 mM leupeptin and 0.2 mM phenylmethylsulphonylfluoride.The homogenate was centrifuged at 11 700 gfor 20 min at 4?C to remove the cell debris.The resultingextract was precipitated with ammonium sulphate(70%(w/v)saturation),centrifuged at 11 700 g for 10 min at4?C.The pr

38、otein was desalted using PD10 column withPD10 buffer(0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8,1.4 mM b-mercaptoethanol,40 mM ascorbic acid and5%(w/v)trehalose).The eluent was used for CHS assayand determining the protein concentration.CHS activity was determined by measuring the amountof naringenin p

39、roduced.The CHS assay was performed at 37?C for 1 h in an assay mixture containing 50 ml protein extract(7 mg ml-1),50 ml assay buffer(0.5 M potassium phosphate pH 6.8,2.8 m M b-mercaptoeth-anol and 2%(w/v)(BSA),5 ml 0.4 mM malonyl CoA(2nmol)and 5 ml 0.2 mM p-coumaroyl CoA(1 nmol).At the end of the

40、incubation period 200 ml degassed EtOAc(ethyl acetate)was added,mixed by vortexing and cen-trifuged at 11 700 g for 5 min.The EtOAc layer was transferred into an Eppendorf tube and evaporated to dryness using a vacuum concentrator.The residue was then dissolved in 20 ml MeOH and analysed by HPLC.The

41、 HPLC system used consisted of an LKB model 2150 HPLC pump,an LKB model 2151 variable wave-length monitor and chromatographic data processor.A guard column packed with octadecyl silica十八烷基硅(30 mm par-ticle size),a 5-m Rosil reverse-phase C18 separation column(Beckmann,250×4.6 mm id)were used.The eluent consisted of MeOH-H2O-85%H3PO4(280:136:1),pH 2.6 and a flow rate of 1 mlm-1 was used with pressure,230 bar.The amount of naringenin produced was analysed by HPLC using the height of the naringenin peak at 290 nm.高性能液體色譜系統(tǒng)包括了LKB模型2150高性能液體色譜泵、LKB模型2151易變的波