實驗三-普通光學(xué)顯微鏡的使用方法及細(xì)菌的革蘭氏染色法

1、實驗三-普通光學(xué)顯微鏡的使用 方法及細(xì)菌的革蘭氏染色法實驗三 普通光學(xué)顯微鏡的使用及細(xì)菌的簡單染色、革蘭氏染色法 生科 15.2 周罡 201500181104【實驗?zāi)康摹? .復(fù)習(xí)光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能 和使用方法。2 .學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。3 .掌握利用顯微鏡觀察不同微生物的基 本技能，了解球菌、桿菌、放線菌、酵母、真 菌在光學(xué)顯微鏡下的基本形態(tài)特征。4 .學(xué)習(xí)并掌握微生物的制片及簡單染色 的基本要求。5 .學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法。6 . 了解革蘭氏染色原理。7 .鞏固顯微鏡操作技術(shù)及無菌操作技術(shù)?！緦嶒炘怼浚ㄒ唬┢胀@微鏡的基本原理生開釜 Irg一町變電5隔r1 .

2、基本原理現(xiàn)代普通光學(xué)顯 微鏡利用目鏡和物鏡 兩組透鏡系統(tǒng)來昂達(dá) 成像，故又稱為復(fù)式顯 微鏡。它們包括機(jī)械部分和光學(xué)部分兩部分。機(jī)械部分包括鏡座、鏡臂、 鏡筒、載物臺、物鏡轉(zhuǎn)換器、粗調(diào)節(jié)螺旋、細(xì)調(diào) 節(jié)螺旋、標(biāo)本夾等。光學(xué)部分包括接目鏡、接物 鏡、反光鏡、光圈（虹采）、聚光鏡（集光器） 等。顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波 長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長 或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波 幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但 不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提 高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是 提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以 提高介質(zhì)

3、折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時折射率為 1, 而香柏油的折射 率為1.51,和載片玻璃的折射 率（1.52）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直 接通過載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。 顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的 乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。2 .油鏡微生物學(xué)使用的顯微鏡的物鏡通 常有低倍鏡（10%、高倍鏡（40X）和油鏡（100X）, 油鏡是三者中放大倍數(shù)最大的，油鏡的焦距和工 作距離最短，油鏡與其他物鏡不同的是載玻片與 物鏡之間隔的不是一層空氣（干燥系），而是一 層油脂，稱為 油浸系”。由于香柏油與玻璃的折 光率相似（香柏油為1.515,玻璃為1.52）。鏡檢 時，滴加

4、香柏油的作用是使光源盡可能多的進(jìn)入 物鏡中，避免光線通過折光率低的空氣（折光率 為1.0）而散失，因而能提高物鏡的分辨率，使 物像明亮清晰（見下圖）圖2介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時光線通過的比較（二）簡單染色的原理細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實驗中的一 項基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光 學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進(jìn)行染色。利 用單一染料對菌體進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體 與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到 其形態(tài)和結(jié)構(gòu)的方法叫做簡單染色。 此法操作簡 便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因為在中 性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常

5、帶負(fù)電 荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶 正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌 結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形 成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作 簡單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基 pH下降時， 細(xì)菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復(fù)紅 或剛果紅等酸性染料染色。染色前必須固定細(xì)菌，其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱 和化學(xué)固定兩種方法。固定時盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。（三）革蘭氏染色法的原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要 性狀。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而 且

6、還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán) 紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用 G+表示；染色 反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌， 用G表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)， 是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。 革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成 的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處 理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小， 通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞 內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性 細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量 高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的 通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出 而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（

7、番紅）的顏色, 因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料 初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。堿性染料初 染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所 述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié) 晶紫。媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親 和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細(xì) 胞上，使不易脫落，碘是常用的媒染劑。脫色劑 是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫 色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色 劑常用95 %的酒精。復(fù)染液也是一種堿性染料， 其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的 細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì) 胞仍然保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成 G

8、和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。經(jīng)此法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì) 菌為革蘭氏陽性菌；細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫 而染上復(fù)染劑的顏色(紅色)的細(xì)菌為革蘭氏陰 性菌。1)g+菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成 一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障 縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈 紫色。2) G一菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫 色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶 解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁， 沙黃復(fù)染后呈紅色?！緦嶒炂鞑摹? .菌種枯草芽抱桿菌牛肉膏蛋白月東瓊脂斜面培養(yǎng)物， 金 黃色葡萄球菌牛肉膏蛋白月東瓊脂斜面培養(yǎng)物， 大 腸桿菌牛肉膏蛋白陳瓊脂斜面

9、培養(yǎng)物，自選菌種 兩種。2 .溶液和試劑草酸鏤結(jié)晶紫染液，盧戈氏(Lugol)碘液，95% 乙醇，番紅復(fù)染液，無菌水，香柏油，二甲苯 3.儀器和其他用品普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙，酒精燈，載玻片，雙 層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，接種環(huán)，滴管 【實驗步驟】(一)顯微鏡的使用方法1 .觀察前的準(zhǔn)備(1) 顯微鏡的安置：置顯微鏡于平 整的實驗臺上，鏡座距試驗臺邊緣約10cm。 鏡檢時姿勢要端正。(2) 光源調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)安裝在鏡座內(nèi) 的光源燈的電壓獲得適當(dāng)?shù)恼彰鲝?qiáng)度。(3) 根據(jù)使用者的個人情況，調(diào)節(jié) 雙筒顯微鏡的目鏡2 .顯微觀察(1) 低倍鏡觀察：將要觀察的玻片 標(biāo)本置于載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推

10、進(jìn)器使觀察對象處在物鏡的正下方， 下降10 X物鏡，使其接近標(biāo)本，用粗調(diào)節(jié)器慢慢升 起鏡筒，使標(biāo)本在視野中初步聚焦，再使用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至圖像清晰。通過玻片夾推進(jìn) 器慢慢移動玻片，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找 到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到 的結(jié)果。(2) 高倍鏡觀察：在低倍鏡下找到 合適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心后，輕 輕轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器將高倍鏡移至工作位置。 對聚光器光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后 微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進(jìn)器移動 標(biāo)本仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。(3) 油鏡觀察：在高倍鏡下找到合 適的觀察目標(biāo)并將其移至視野中心，將高倍 鏡轉(zhuǎn)離工作位置，在待觀察的樣品區(qū)域上滴 上一滴

11、香柏油，將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，油鏡 鏡頭此時應(yīng)正好浸泡在鏡油中。調(diào)節(jié)照明使 視野的亮度合適，微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清 晰，利用推進(jìn)器移動標(biāo)本仔細(xì)觀察并記錄所 觀察到的結(jié)果。3 .顯微鏡用畢后的處理(1)上升鏡筒，取下載玻片。(2)用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡 油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去鏡頭上殘留的油跡， 最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲 苯。(3)用擦鏡紙清潔其他物鏡及目 鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。(4)將各部分還原，將光源燈亮 度調(diào)至最低后關(guān)閉，將最低放大倍數(shù)物 鏡轉(zhuǎn)到工作位置，同時將載物臺降至最 低位置。(二)細(xì)菌制片及簡單染色1 .涂片取一塊載玻片，在玻片的一面用記

12、號筆做好 標(biāo)記，在標(biāo)記的一面上邊用膠頭滴管加一小滴無 菌水，用接種環(huán)無菌操作分別由枯草芽泡桿菌營 養(yǎng)瓊脂斜面和金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面挑 取適量菌苔，將沾有菌苔的接種環(huán)置于載玻片上 的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可。2 .干燥與固定涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物， 固定過程應(yīng)使載玻片通過火焰 2-3次，注意溫度 的控制，過熱的溫度會將細(xì)菌殺死，溫度以手背 感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)。3 .染色將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫 染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5min。4 .水洗傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水 沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無色為止。5 .干燥用吸水紙吸去多余

13、水分后自然干燥，或?qū)⑤d 玻片通過火焰2-3次。6 .鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先 低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅?將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察 細(xì)菌的形態(tài)。（三）革蘭氏染色1 .涂片取一塊載玻片，在玻片的一面用記號筆做好 標(biāo)記，在標(biāo)記的一面上邊用膠頭滴管加幾小滴無 菌水，分別取5種活躍生長期菌種（金黃色葡萄 球菌，大腸桿菌，枯草芽泡桿菌，自選菌（1）, 自選菌（2）按常規(guī)方法涂片（不宜過厚）。2 .干燥與固定涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過程應(yīng)使載玻片通過火焰 2-3次，注意溫度 的控制，過熱的溫度會將細(xì)菌殺死，溫度以手背 感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)。3 .初染滴加草酸鏤結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色 1.5min后傾去染液，水洗至流出水無色。4 .媒染先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆 蓋1min,傾去碘液，水洗至流出水無色。5 .