實(shí)驗(yàn)十,發(fā)酵過(guò)程中的還原糖測(cè)定.

1、實(shí)驗(yàn)十、發(fā)酵過(guò)程中的還原糖測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)和掌握發(fā)酵過(guò)程中的取樣操作。2、了解還原糖的各種測(cè)定方法；掌握DNS 法測(cè)定的操作方法及注意事項(xiàng)。3、了解青霉素發(fā)酵過(guò)程中還原糖對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響。 實(shí)驗(yàn)原理 一)發(fā)酵過(guò)程中的取樣操作取樣操作是發(fā)酵過(guò)程中在線控制的重要內(nèi)容； 只有通過(guò)取樣才能對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的諸多參 數(shù)進(jìn)行測(cè)定，以求進(jìn)一步的控制。操作要注意動(dòng)作協(xié)調(diào)、快速，不能造成發(fā)酵罐的污染，嚴(yán)格按照相應(yīng)程序進(jìn)行。盛放樣 品的器皿也要潔凈、無(wú)菌，以防止對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。二)發(fā)酵過(guò)程中的還原糖測(cè)定單糖和某些寡糖含有游離的醛基或酮基， 有還原性， 屬于還原糖。 而多糖和蔗糖等屬于 非還原性糖； 利用多

2、糖能被酸水解為單糖的性質(zhì)可以通過(guò)測(cè)定水解后的單糖含量對(duì)總糖進(jìn)行 測(cè)定。青霉素的發(fā)醇工藝是通過(guò)一系列工藝參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 這些參數(shù)中包括物理參數(shù)， 即溫度、壓力等。二是化學(xué)控制系數(shù)，即pH、糖的濃度等；其中糖的濃度是控制發(fā)酵過(guò)程中的重要因此，測(cè)知發(fā)酵過(guò)參數(shù)之一。 由于碳源對(duì)于發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)及青霉素合成都有較大影響。程中還原糖濃度變化，對(duì)青霉素發(fā)酵控制有重要的指導(dǎo)意義。還原糖的測(cè)定方法有很多，一般有菲林試劑法、酶法和DNS 法。A 、菲林試劑法菲林試劑由質(zhì)量濃度為 0.1g/mL 的 NaOH 溶液和質(zhì)量濃度為 0.05g/mL 的 CuSO4 溶液配 制而成，二者混合后，立即生成淡藍(lán)色的 Cu(

3、0H)2沉淀。Cu(0H)2在加熱條件下與醛基反應(yīng),被還原成磚紅色的 Cu2O 沉淀，醛基則被氧化為羧基。利用菲林溶液與還原糖共沸，生成氧化亞銅沉淀的反應(yīng)，以次甲基藍(lán)為指示液， 以樣品或經(jīng)水解后的樣品滴定煮沸的菲林溶液， 達(dá)到終點(diǎn)時(shí)， 稍微過(guò)量的還原糖將藍(lán)色的次甲基沉(沉還原為無(wú)色，以示終點(diǎn)。根據(jù)樣品消耗量求得總糖或還原糖的含量。用菲林試劑鑒定可溶性還原糖時(shí)，溶液的顏色變化過(guò)程為：淺藍(lán)色7棕色7磚紅色 淀)。B、酶法又稱葡萄糖氧化酶過(guò)氧化物酶法。 葡萄糖氧化酶可將葡萄糖氧化成葡萄糖酸并產(chǎn)生過(guò)氧化氫， 后者與苯酚及安替比林在過(guò)氧化物酶作用下生成紅色化合物，葡萄糖的濃度與紅色深淺成一定比例。般可采

4、用葡萄糖測(cè)定的試劑盒，測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快速C、DNS 法又稱 3， 5二硝基水楊酸法。在堿性溶液中，還原糖變?yōu)橄┒?，烯二醇可?， 5二硝基水楊酸氧化為糖酸。加熱進(jìn)一步產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)的深淺成一定比例關(guān)系，通過(guò)此比例測(cè)定還原糖的含量。三種方法各有不同的應(yīng)用和使用范圍， 應(yīng)根據(jù)具體情況選擇。 例如菲林法容易受青霉素效價(jià)及其他還原性物質(zhì)的干擾且滴定終點(diǎn)不易判斷，誤差較大；酶法專一性強(qiáng)且結(jié)果準(zhǔn)確，但成本較高，適宜精確測(cè)定；而 DNS 法則結(jié)果準(zhǔn)確且操作相對(duì)簡(jiǎn)單；在生產(chǎn)和研究中應(yīng)用相對(duì)更為廣泛。 實(shí)驗(yàn)材料 1、分析試劑DNS顯色劑 每lOOOmIDN

5、S溶液含有酒石酸鉀鈉182g,無(wú)水亞硫酸鈉 3g,氫氧化鈉20g, 3, 5二硝基水楊酸6.3g，重蒸餾酚 4g。配后過(guò)濾放置半月后使用。1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后定容至100ml，冰箱保存?zhèn)溆?.10%ZnSO 4溶液 .2、器材分光光度計(jì)，定糖管，移液管，容量瓶，燒杯，電爐等。 方法步驟 一）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取 9 只定糖管（有蓋子，且用繩子系?。謩e按照下表 1 的順序加入各種試劑，沸水浴中加熱 5min ，后立即流動(dòng)水冷卻。管內(nèi)溶液混勻， 用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，520nm 測(cè)定光密度值 （O.D.） ，以葡萄糖含量為 橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪

6、制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。表 1 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)各試劑用量項(xiàng)目CK12345678含糖總量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS 試劑(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱 5mi n冷卻立即用流動(dòng)冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度(520nm)(二)青霉素發(fā)酵液的制備按照發(fā)酵罐取樣的操作規(guī)程取樣，并用潔凈的三角瓶盛放。(三)

7、青霉素發(fā)酵液的制備取一定體積的青霉素發(fā)酵液在12000rpm下離心10min去除產(chǎn)黃青霉菌絲體。準(zhǔn)確量取5ml發(fā)酵上清液(視含糖量高低而定，在發(fā)酵周期內(nèi)不同時(shí)期取樣數(shù)量應(yīng)有所不同)于100ml 容量瓶中，加入10ml 10%ZnS04溶液，用堿液(NaOH 3mol/L )調(diào)節(jié)顯堿性，以水稀釋至刻度、搖勻；通過(guò)干燥濾紙過(guò)濾。按照表2加入相應(yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng)。520nm測(cè)定光密度值,最后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出發(fā)酵液所含還原糖的量。每管測(cè)定三次，求平均值。表2青霉素發(fā)酵液所含還原糖的測(cè)定項(xiàng)目CK123發(fā)酵液(ml)00.80.80.8蒸餾水(ml)2.01.21.21.2DNS 試劑(m1)1.51.

8、51.51.5加熱均在沸水浴中加熱 5mi n冷卻立即用流動(dòng)冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.5光密度(520nm)注意:1、實(shí)驗(yàn)中所有的試管要干凈，加入各種試劑量要準(zhǔn)確。2、試劑不可倒出試劑瓶，用干凈的移液管吸取，用后蓋好瓶塞，防回原處。3、定糖管的管口在加熱時(shí)不可朝向人，以免糖液過(guò)度沸騰飛濺傷人。R2>97%）。如果繪制時(shí)濃度過(guò)4、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制要準(zhǔn)確，盡量符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（度分散需重做依次。5、分光光度計(jì)使用：溶液不要倒太多；毛邊不要對(duì)著透光處； 用后用自來(lái)水沖洗干凈, 防回原處。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、填寫(xiě)表1，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。葡萄糖含量（mg值 光 吸系列1 線

9、性（系列1）項(xiàng)目CK12345678含糖總量（mg）00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS 試劑(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱 5mi n冷卻立即用流動(dòng)冷水冷卻蒸餾水（ml）21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度（520nm）0-0.0120.0320.0670.1090.2030.1760.3620.34葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2、根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出發(fā)酵液

10、中還原糖的濃度。經(jīng)過(guò)24h發(fā)酵后側(cè)得發(fā)酵液的吸光值項(xiàng)目CK123發(fā)酵液(ml)00.80.80.8蒸餾水(ml)2.01.21.21.2DNS 試劑(m1)1.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱 5mi n冷卻立即用流動(dòng)冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.5光密度(520nm)00.6840.5130.626光密度平均值0.608葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.054x 0.0833測(cè)定葡萄糖的含量x=(y+0.0833)/0.054= (0.608+0.0833) /0.054=22.852 mg發(fā)酵液中還原糖濃度 C= (22.852/0.8 )X 100/5=571.3mg/ml 思考題1、測(cè)定青霉素發(fā)