動物實驗室疾病診斷工作流程

1、生物實驗室疾病診斷工作流程 流程： 業(yè)務接收流程：客戶內(nèi)勤研發(fā)部生物實驗室 業(yè)務反饋流程： 生物實驗室內(nèi)勤客戶 實施細則 :一、樣品采集與運輸1. 病料的采集要求：(1) 新鮮，代表性。病料存放時間夏天少于6h，冬天12-24h.(2) 減少污染。第一時間采取病料，減少病料因暴露于空氣中而造成的污染。( 3)病料采集后，應先存放于冰箱中1-2 小時后，再做微生物檢驗2. 病料的采集方法( 1 )組織和實質(zhì)器官的采集 采集病料心、肝、脾臟、胰腺、肺等，剪切小塊組織，放入滅菌試管(青霉素瓶)，密封。( 2)液體病料的采集 血液、膽汁、膿腫液、滲出物等液體病料，使用注射器(或滅菌吸管)吸取病變組織的

2、 液體，將病料注入滅菌試管(青霉素瓶) ，塞好棉塞送檢。( 3 )全血的采集方法 用注射器自雞的心臟或翅靜脈采血 2-5 毫升，注入滅菌試管(青霉素瓶)中。( 4)血清的采集方法 用滅菌注射器自雞的心臟或翅靜脈采血 2 毫升，注入滅菌試管中(青霉素瓶)擺成斜 面，待血液凝固血清析出后，將血清吸出注入另一個滅菌試管中，備用。采樣的比例：按每個舍 0.5%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常規(guī)采樣 15-30 份即可。二、檢測項目項目一、藥敏試驗試驗步驟1. 試驗材料 ：培養(yǎng)基、藥敏試紙、細菌、接種環(huán)、酒精燈、打 孔器、移液器、滴頭。2.試驗準備 ：藥液的制備 （用于商品藥的試驗 ） ：按商品

3、藥使用治療量的比例配制藥 液；如商品藥“百病消”按其說明量治療量 0.01%飲水，可按這個比例配 制藥液，可取 10毫克加入 10 毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏 試驗的藥液。3. 試驗操作方法：3.1 藥敏片法3.1.1 在“超凈臺”中，用經(jīng) （ 酒精燈 ） 火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培 養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。 具體方式； 用滅菌接種環(huán)取適量 細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的 1/2 。找到第 二點劃線至平皿的 1/2 ，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。 （另可挑取待試 細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液， 用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸

4、液涂布于 平皿培養(yǎng)基表面，涂布均勻致密 ） 。3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。 為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼， 可用鑷子輕按幾下藥敏片。 為了使能準確的觀 察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上； 一般可在平皿中央貼一片， 外周可等距離貼若干片 （ 外周一般可貼七片 ） ，每種藥敏片的名稱要記住。3.1.3將平皿培養(yǎng)基置于37°C溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。二、結(jié)果觀察：過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之 越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線 細菌濃度有直接關(guān)系。三

5、、結(jié)果判定藥敏試驗的結(jié)果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。實驗條件不同，判定標準有所不同。對于一般抑菌環(huán)的直徑，20 mn以上極敏;15 mm以上者為高度敏感；10-15 mn為中度敏感；10mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán) 者為耐藥。抗菌藥物紙片含藥量（卩 g /mL）抑菌圈直徑（mm）不敏感低度敏感中度敏感敏感青霉素:500< 1010 26> 26鏈霉素5000< 1010 15> 15氯霉素7000< 1010 20> 20新霉素3000< 1010 25> 25多黏菌素抑菌圈在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。

6、四、應用藥物敏感試驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，這樣才會達到好的治療效果。項目二、抗體試驗一、實驗用設備：離心機1臺、冰箱1臺、振蕩器1臺、抗原、96孔V型板、八道移液器、吸頭、積 液槽、一次性采血管、2毫升注射器、紅細胞、檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀、硫酸、吸管、吸耳 球、針頭、蒸餾水、10毫升離心管、生理鹽水。二、實驗過程：（一）血凝（HA）試驗：采用96孔V型反應板，測定抗原效價（二）4單位抗原校正：（三）血凝抑制（HI ）試驗：每排孔檢查1份血清。（四）結(jié)果判定：1） 判定結(jié)果：以完全抑制紅細胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴

7、度，以2的 指數(shù)表示。2）判定標準：1. 新城疫抗體：育雛育成雞在7以上，產(chǎn)蛋雞在 9以上。2. H5抗體：抗體值在 6以上。3. H9抗體：抗體值在 7以上。注：低于以上標準，則需要進行免疫。3）免疫后抗體規(guī)律一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達峰值，可以維持2個月。滅活疫苗免 后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達峰值，可以維持3-4個月。項目三、PCR檢測一、PCR反應的條件設置PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。1 溫度與時間的設置基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點 法，雙鏈DNA在9095C變性，再迅速冷卻至 4060C，

8、弓I物退火并結(jié)合到靶序列上， 然后快速升溫至 7075C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短 靶基因（長度為100300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合 二為一，一般采用 94C變性，65C左右退火與延伸（此溫度 Taq DNA酶仍有較高的催化活 性）。2. 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度，一般的循 環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。二、PCR擴增產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，其結(jié)果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定， 才能得出正確的結(jié)論。 PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方 法。三、PCR結(jié)果異常分析PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h以內(nèi)，有些最好