生物2班三組

1、酶抑制法酶抑制法殘留農(nóng)藥的檢測(cè)方法 -酶抑制法生物制藥2 三組酶抑制法酶抑制法.有機(jī)磷、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在施用后，容 易受外界條件影響而分解。但有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥中存在著部分高毒和劇 毒品種，如甲胺磷、對(duì)硫磷 涕滅威、克百威、水胺硫磷等，如果被施用于生長(zhǎng)期較短、連續(xù)采收的蔬菜，則很難避免因殘留量超標(biāo)而導(dǎo)致人畜中毒。 在一定條件下， 有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)藥物對(duì)膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與藥物的濃度相關(guān)，正常情況下 ，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑 反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，通過(guò)抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)藥物的存在。

2、酶抑制法酶抑制法檢測(cè)原理利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)動(dòng)物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（ AChE ）具有抑制作用的原理，在乙酰膽堿酯酶及其底物（乙酰膽堿）的共存體系中加入農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液（樣品中含有水），如果樣品中不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，酶的活性就不被抑制，乙酰膽堿就會(huì)被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生顏色；反之，如果試樣提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，酶的活性就被抑制，試樣中加入的底物就不能被酶水解，從而不顯色。 水解水解加酶加酶顯色劑顯色劑未水解未水解顯色劑顯色劑不顯色不顯色顯色顯色無(wú)農(nóng)藥無(wú)農(nóng)藥有農(nóng)藥有農(nóng)藥酶抑制法酶抑制法實(shí)驗(yàn)過(guò)程酶抑制法酶抑制法觀(guān)察現(xiàn)象 用目測(cè)顏色的變

3、化或分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，計(jì)算出抑制率，就可以判斷出樣品中農(nóng)藥殘留的情況。 AChE 屬于絲氨酸為中心的酶類(lèi)，羧酸酯酶（非特異性酯酶的一種）與 AChE 類(lèi)似，同樣以絲氨酸殘基作為活動(dòng)中心。酶抑制法酶抑制法酶的基質(zhì)和顯色反應(yīng)類(lèi)型 1.酶的基質(zhì) 酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的基質(zhì)（底物）和顯色劑很多。 各種乙酰膽堿（ ACh ）、乙酰萘酯以及其他羧酸酯、乙酸羥基吲哚及其衍生物 考慮：靈敏度，適用性，酶源、基質(zhì)、顯色劑獲得難易 1. 肉眼觀(guān)察法酶片法、試紙法、速測(cè)卡法基于反應(yīng)體系反應(yīng)前后明顯的顏色變化來(lái)觀(guān)察、判斷農(nóng)藥毒性高低的一種定性測(cè)量方法。一般選用靛酚乙酸酯（紅色）為底物。 檢測(cè)方法酶抑制法酶抑制

4、法酶抑制法酶抑制法原理是： 膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過(guò)程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥。 酶抑制法酶抑制法速測(cè)卡以濾紙作載體，白紙片上載有乙酰膽堿酯酶和基質(zhì)，紅紙片載有顯色劑。 當(dāng)空白樣品加于白紙片上，在酶作用下，乙酰膽堿與水發(fā)生水解，水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。當(dāng)含有有機(jī)磷和氨基甲酸醋類(lèi)農(nóng)藥的樣品加于白紙片上時(shí)，抑制了乙酰膽堿酯酶的活性，使這種酶不能被水解，從而無(wú)顯色反應(yīng)。酶抑制法酶抑制法實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象白色藥片變成藍(lán)色，說(shuō)明農(nóng)藥殘留無(wú)或在檢出限下；白色藥片不變藍(lán)，說(shuō)明

5、含有超出檢出限的農(nóng)藥。酶抑制法酶抑制法農(nóng)藥速測(cè)卡對(duì)幾種常用農(nóng)藥的最低檢測(cè)限（單位mg/kg）如下：甲胺磷 1.7 馬拉硫磷 2.0 水胺硫磷 3.1 對(duì)硫磷 1.7 久效磷 2.5 乙酰甲胺磷 3.5 敵敵畏 0.3 樂(lè)果 1.3 敵百蟲(chóng)0.3 呋喃丹 0.5 西維因 2.5 好年冬 1.0 酶抑制法酶抑制法（1）整體測(cè)定法選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成 1cm 左右見(jiàn)方碎片，取 5g放入帶蓋瓶中，加入 10ml 純凈水或 0.1mol /L pH7.5 的磷酸緩沖液 水與菜葉的比例以 ( 1 : l ) ( l :2 ）為宜 ，震搖 50 次，靜置2min 以上。取一片速測(cè)卡，用

6、白色藥片蘸取提取液，放置 10min 以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在 37 恒溫裝置中放置 10min 。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏 3min 或用恒溫裝置恒溫 3min ，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)純凈水或緩沖液的空白對(duì)照卡。酶抑制法酶抑制法（2）表面測(cè)定法擦去蔬菜表面泥土，滴 2 3 滴洗脫液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。取一片速測(cè)卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上放置 10min 以上進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在 37 恒溫裝置中放置 10min 。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏 3min 或用恒溫裝置恒溫 3min

7、 ，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)洗脫液的空白對(duì)照卡。- -酶抑制法酶抑制法 試紙法（速測(cè)卡法）操作簡(jiǎn)單、成本低，但對(duì)于深顏色樣品的檢測(cè)， 實(shí)驗(yàn)誤差較大，而植物酶片用于植物樣品檢測(cè)時(shí)也存在基體干擾問(wèn)題，操作者人為因素較大，靈敏度較低，只能勉強(qiáng)算是一種定性方法。 - -酶抑制法酶抑制法 2.比色法 檢測(cè)箱法、酸堿指示劑法、試劑盒法、速測(cè)靈法 檢測(cè)原理:利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)動(dòng)物和昆蟲(chóng)的毒性作用是通過(guò)特異性抑制膽堿酯酶（ ChE ）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但結(jié)果的判定是根據(jù)比色管溶液的變化通過(guò)目測(cè)比色來(lái)完成的。 加入20ml提取試劑提 取 取1g樣品（非葉菜類(lèi)取4g），切碎取 樣振蕩12min抑制反應(yīng)將上清液倒入試管中，靜止3min，加入50ul酶，3ml樣品提取液，50ul顯色劑培 養(yǎng)倒入比色杯測(cè)定儀器測(cè)定酶抑制法酶抑制法酶抑制法酶抑制法酶源種類(lèi)與酶液制備 1 酶源的種類(lèi) 酶源選擇是生物酶技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)，其性質(zhì)的好壞、特異性大小、穩(wěn)定與否直接關(guān)系到檢測(cè)的結(jié)果。 各種農(nóng)藥對(duì)一些酶的活性均有不同程度的抑制作用。酶抑制法酶抑制法 常用的酯酶： 動(dòng)物（牛、豬、綿羊、猴、鼠、兔或雞）的肝臟酯酶； 人血漿或血清； 馬血清或黃鱔血中的膽堿酯酶； 蜜蜂或蠅頭的腦酯酶； 動(dòng)物（兔、牛、鼠）的羧酸酯酶。 肝酯酶和植物酯酶應(yīng)用較少，常用的