虎杖苷對燒傷血清和LPS作用下大鼠平滑肌細(xì)胞蛋白激酶C活性的影響(一)

1、虎杖苷對燒傷血清和LPS作用下大鼠平滑肌細(xì)胞蛋白激酶C活性的影響(一)    作者：王月剛，金春華，黃海瀟，吳平生【關(guān)鍵詞】 虎杖苷基金項目：國家自然科學(xué)基金【Abstract】 AIM: To explore the mechanism of polydatin (PD) treating shock through studying the influence of PD on the activity of protein kinase C (PKC) of vascular smooth muscle cells (VSMC) when trea

2、ted by sera from burned rats and lipopolysaccharide (LPS). METHODS: After VSMC was treated by sera from burned rats or LPS, the activity of PKC was measured by scintillation counting instrument. RESULTS: Activity of PKC of VSMC cytoplasm after treated by sera from burned rats decreased (P0.05 vs nor

3、mal group), but activity of PKC of cell membrane increased (P0.05 vs normal group). When VSMC was treated with PD, the activity of PKC of VSMC cytoplasm increased and that of cell membrane decreased (P0.05 vs burned group and control group, P>0.05 vs normal group). However, the activity of PKC of

4、 VSMC cytoplasm and cell membrane treated by LPS increased (P0.05 vs normal group), after PD treated VSMC the activity of PKC decreased again (P0.05 vs LPS group and control group, P>0.05 vs normal group). CONCLUSION: PD antagonizes the damage effects of LPS and sera of burned rats by reversing t

5、he PKC activities, which may be one of the molecular mechanisms of PD antishock property.【Keywords】 burn; lipopolysaccharide; smooth muscle cell; polydatin; protein kinase C【摘要】 目的:觀察虎杖苷(PD)對燒傷血清和脂多糖（LPS）作用下大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）蛋白激酶C（PKC）活性的影響，探討其抗休克的機(jī)制. 方法:取大鼠胸主動脈培養(yǎng)VSMC，用燒傷血清和LPS刺激VSMC后，閃爍計數(shù)儀測定PKC活性. 結(jié)果：

6、 燒傷血清作用后VSMC胞質(zhì)PKC的活性下降(vs正常組P0.05)，但胞膜的PKC活性上升（vs正常組P0.05），經(jīng)PD治療后胞質(zhì)PKC的活性上升（vs燒傷組、治療對照組P0.05，vs正常組P>0.05），胞膜的PKC活性下降（vs燒傷組、治療對照組P0.05, vs正常組P>0.05）. LPS刺激后VSMC胞質(zhì)與胞膜PKC的活性均上升（vs正常組P0.05），經(jīng)PD處理后其活性又均下降（vs LPS組、治療對照組P0.05，vs正常組P>0.05）. 結(jié)論： PD對燒傷血清和LPS作用下的VSMC的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)PKC的活性來發(fā)揮作用的，這可能是其抗休克的分

7、子機(jī)制之一.【關(guān)鍵詞】 燒傷；脂多糖；平滑肌細(xì)胞；虎杖苷；蛋白激酶C0引言虎杖苷(polydatin, PD)是從中藥虎杖中提取的主要成份，在體動物實驗表明PD對燒傷性、感染性休克有良好療效，治療休克動物的存活時間和存活率均明顯優(yōu)于6542和多巴胺1. 平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell, SMC)在小血管的收縮擴(kuò)張中占據(jù)著主導(dǎo)地位，而蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）的活性則對VSMC的收縮功能起著重要的調(diào)節(jié)作用2. 對于感染性休克來講，細(xì)菌內(nèi)毒素起了重要的作用，內(nèi)毒素的主要成份為脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，因此我們用LPS刺

8、激大鼠SMC來模擬感染性休克，同時，我們也應(yīng)用燒傷血清刺激SMC來模擬燒傷性休克，觀察了PD在此種情況下對SMC PKC活性的影響，以探討PD抗休克的作用機(jī)制.1材料和方法1.1材料清潔級SD大鼠，40只，體質(zhì)量180220 g，雌雄不拘，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供. PD由?；瘜W(xué)教研室提純制備. LPS(濃度2.5 g/L)，磷脂酰絲胺酸（phosphatidylserine, PS）,組蛋白S型（histone）,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）和Triton X100購自Sigma公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 32PATP

9、, ATP(250 mmol/L), CaCl2, MgCl2, DTT, Hepes, 蔗糖，TrisHCl, EGTA, EDTA, 烏拉坦, 氯醛糖等均為國產(chǎn)試劑. PD用DHanks液配制成2 mmol/L，避光保存. PS用氯仿配制成2 g/L，避光貯于-20. PMSF用異丙醇配制成100 mmol/L，-20保存. LS6500型液體閃爍計數(shù)儀（Bechman公司，測量PKC的活性），低溫高速離心機(jī)（Bechman Avanti J25, 提取PKC用）.1.2方法1.3分組實驗分兩部分，一部分為燒傷血清刺激，一部分為LPS刺激，n=5. 燒傷血清刺激分正常組（不加任何處理因素）

10、，燒傷組（大鼠燒傷血清刺激1 h，血清濃度為200 mL/L），治療組（在燒傷組處理完畢后加PD治療2 h，PD終濃度為0.4 mmol/L），治療對照組（在燒傷組處理完畢后加與PD等量的DHanks，作用2 h）；LPS刺激分正常組（未做任何處理），LPS刺激組（加入LPS使其終濃度為100 g/L，刺激30 min），治療組（在LPS刺激組基礎(chǔ)上加PD，終濃度為0.4 mmol/L，作用2 h），治療對照組（在LPS刺激組基礎(chǔ)上加與PD等量的DHanks，作用2 h）.統(tǒng)計學(xué)處理： 結(jié)果用x±s表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析.2結(jié)果2.1PD對燒傷血清刺激

11、后SMC胞質(zhì)及胞膜PKC的影響胞質(zhì)：燒傷組的PKC活性比先前有所下降，與正常組比較P0.05. 經(jīng)PD治療后PKC的活性有所上升，與燒傷組比較P0.05，與正常組相比P>0.05. 而治療對照組的活性上升更高, 與燒傷組和治療組比較P0.05. 胞膜：燒傷可以使胞膜PKC的活性上升，P0.05. 而經(jīng)PD治療后PKC的活性有所恢復(fù)，與燒傷組相比較P0.05. 而治療對照組的PKC活性與治療組相比較P0.05，與燒傷組比較P>0.05(表1).2.2PD對LPS刺激下SMC胞質(zhì)及胞膜PKC活性的影響胞質(zhì)：LPS刺激后細(xì)胞胞質(zhì)PKC的活性升高，與正常組相比P0.05. 經(jīng)PD治療后PK

12、C活性有下降，與LPS刺激組相比P0.05，而治療對照組PKC活性沒有恢復(fù). 胞膜：SMC胞膜PKC的活性也上升，與正常組相比P0.05. 經(jīng)PD治療后PKC的活性有所下降，與LPS刺激組相比P0.05. 不同的是治療對照組的PKC活性下降更明顯，與治療組和正常組相比P值均0.01(表1).表1虎杖苷(PD)對燒傷血清及脂多糖（LPS）刺激下大鼠平滑肌細(xì)胞(SMC)蛋白激酶C活性的影響3討論本實驗中，燒傷血清刺激VSMC 2 h后, 胞質(zhì)的PKC活性下降，胞膜PKC的活性上升，表明燒傷血清的作用主要是促進(jìn)PKC的激活轉(zhuǎn)位. 而PD處理則減低了胞膜PKC的活性，升高了胞質(zhì)中PKC活性. 表明PD

13、可對抗燒傷血清引起的PKC異常變化. 實驗中我們還發(fā)現(xiàn)治療對照組的胞質(zhì)PKC活性升高很多. 其原因可能為，治療對照組是在燒傷血清的基礎(chǔ)上加DHanks液，并沒有去除燒傷血清，使燒傷血清的刺激作用長期存在，導(dǎo)致大量脂質(zhì)氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，這些物質(zhì)可以顯著減慢DAG的降解2,5，從而持續(xù)不斷的激活PKC，使胞質(zhì)中PKC的活性持續(xù)升高，提示PD對燒傷治療的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)PKC的活性有關(guān). 它通過維持PKC活性的穩(wěn)定來減輕機(jī)體的損傷.在感染性休克發(fā)生過程中，LPS是主要的致病因素. 從本實驗結(jié)果來看，LPS刺激VSMC后，細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜的PKC活性均升高，表明LPS引起的損傷效應(yīng)至少有部分是通過PKC信

14、號系統(tǒng)介導(dǎo)的. 其激活PKC的機(jī)制可能有以下幾方面6：LPS能直接引起肌醇磷脂分解產(chǎn)生DAG，從而激活PKC；同時LPS與十四佛波乙酸酯相似，有可能以佛波酯類物質(zhì)的方式直接激活PKC；此外，它還可以使機(jī)體釋放大量血管緊張素、兒茶酚胺等因子，這些因子也能引起細(xì)胞膜肌醇磷脂分解產(chǎn)生DAG，進(jìn)一步激活PKC.LPS損傷的VSMC給予0.4 mmol/L PD作用后，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜PKC的活性均減低. 提示PD可能是通過影響PKC的活性來對抗LPS的損害作用，但是PD是通過什么機(jī)制調(diào)節(jié)PKC的活性還不太清楚. 對于治療對照組，其胞質(zhì)的PKC活性與LPS組相比沒有太大變化，而胞膜的PKC活性降低較顯著，

15、這可能是由于PKC的耗竭機(jī)制和自我反饋機(jī)制而導(dǎo)致. 由于LPS的刺激在對照組并沒有去除，其持續(xù)刺激一方面導(dǎo)致PKC的大量消耗，到后期沒有足夠的PKC從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜上，另外一個方面可能是由于PKC活性的升高反饋性的抑制了胞膜PKC的活性，從而降低了胞膜PKC的活性5.但是與燒傷損傷不同的是，LPS激活后的PKC并沒有使平滑肌的收縮性增強，反而使其收縮性下降5. 這可能是由于LPS激活的PKC同工酶與其它損傷所激活的同工酶不同，進(jìn)而導(dǎo)致其作用底物不同而致. PKC的同工酶不少于12種，其中cPKC包括PKC,和，而nPKC則包括PKC，和. 在LPS刺激SMC時，主要是PKC，和被激活. PKC

16、的磷酸化使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）活化，iNOS的增加導(dǎo)致了NO的大量合成，NO為強烈的舒血管因子，可以使血管強烈擴(kuò)張. 由于LPS持續(xù)的刺激，PKC被持續(xù)激活，iNOS也就大量產(chǎn)生，使NO在胞內(nèi)的含量增加，從而導(dǎo)致了SMC收縮性的下降.【參考文獻(xiàn)】1 黃巧冰，趙克森，黃緒亮. 虎杖4號與多巴胺、6542治療大鼠失血性休克療效的比較J. 微循環(huán)學(xué)雜志， 1995, (1): 7-9.2 Begum N, Duddy N, Sandu O, et al. Regulation of myosinbound protein phosphatase by insulin in vascular

17、 smooth muscle cells: eva luation of the role of rho kinase and phosphatidylinositol3kinasedependent signaling pathwaysJ. Mol Endocrinol, 2000, 14(9):1365-1376.3 鄂征. 組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)M. 北京:北京出版社, 1995: 131.4 Pease DC, Paule WJ. Electron microscopy of elastic arteries; the thoracic aorta of the ratJ. J Ultrastruct Res, 1960, 3: 469-483.5 Ha H, Yu MR, Choi YJ, et al. Activation of protein kinase cdelat and cepsilon by oxidative stress