藻類葉綠素a的測(cè)定精

1、藻類葉綠素 a 的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)名稱藻類葉綠素 a 的測(cè)定二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（水）環(huán)境化學(xué)中葉綠素 a 測(cè)定意義 在地表水環(huán)境的富營(yíng)養(yǎng)化的研究中，葉綠素 a 是表征浮游植物生物量的最常用的指標(biāo) 之一。同時(shí)，葉綠素 a 也是用來(lái)衡量水體水質(zhì)，評(píng)價(jià)水體富營(yíng)養(yǎng)化水平的標(biāo)準(zhǔn)之一。三、實(shí)驗(yàn)原理葉綠素介紹葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。 所有光合器官中都含有葉綠素。葉綠素 a 和 b 都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，難溶于石油醚， 有旋光，主要吸收橙紅光和藍(lán)光。因此，這兩種光對(duì)光合作用最有效。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后， 葉綠素即游離出來(lái)，游離葉綠素不很穩(wěn)定，光、熱、酸、堿、氧、氧化

2、劑等都會(huì)使其分解。 在酸性條件下， 葉綠素中的鎂原子很容易被其他酸代替， 綠色消失而變黃， 葉綠素生成綠褐 色的脫鎂葉綠素，加熱時(shí)反應(yīng)加速。葉綠素的實(shí)驗(yàn)室測(cè)量方法有分光光度法、 熒光法、 色譜法， 其中以傳統(tǒng)的分光光度法應(yīng) 用最為廣泛。 根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收， 利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下 測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度 C和液層厚度L成正比，即：A = a ?C?L式中：a為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分比濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。 各有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過

3、測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在 不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。 如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)， 則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸 光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。（1 ）單色法已知葉綠素 a的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm,已知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04，因此CA=A663/82，可以計(jì)算出葉綠素 a 的含量 （mg/L） 。（2）三色法已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm且兩吸收曲線相交于 652nm 處。因此測(cè)定提取液在645nm、 663nm、 652nm 波長(zhǎng)下的吸光值

4、，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式便可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。已知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：A663=82.04Ca +9.27Cb (1)A645=16.75Ca+45.6Cb式中A663 A664分別為波長(zhǎng)663nm和645nm處測(cè)定葉綠素溶液的吸光度值；Ca、Cb分別為葉綠素 a、 b 的濃度 (g/L) 。解聯(lián)立方程 (1) 、 (2) 可得以下方程：Ca=0.0127A663- 0.00269A645(3)Cb=0.0229A645- 0.0046

5、8A663(4)如把葉綠素含量單位由 g/L 改為 mg/L， (3) 、 (4) 式則可改寫為：Ca(mg/L)=12.7A663- 2.69A645(5)Cb(mg/L)=22.9A645- 4.68A663(6)葉綠素總量 CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663(7)葉綠素總量也可根據(jù)下式求導(dǎo)A652=34.5X CT由于652nm為葉綠素a與b在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(diǎn)(等吸收點(diǎn)),兩者有相同的比吸收系數(shù) ( 均為 34.5) ，因此也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度 (A652) 求出葉綠素總量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652X

6、1000/34.5 (8)因此，可利用、式可分別計(jì)算葉綠素 a與b含量，利用式或(8)式可計(jì)算葉綠 素總量。從上可見，葉綠素提取后測(cè)定又可以分為兩種：?jiǎn)紊?663nm)與三色法(645nm、663nm652nm)。具體使用單色法還是三色法將依據(jù)測(cè)定對(duì)象而定。在標(biāo)準(zhǔn)方法、 超聲波法、 反復(fù)凍融法、 延時(shí)提取法、 熱丙酮法、 丙酮加熱法、 熱乙醇法、 混合溶劑法等多種常見浮游植物葉綠素a 測(cè)定方法中，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微囊藻(Microcystis aeruginosa )水華樣品為研究對(duì)象進(jìn)行的葉綠素 a 含量測(cè)定。不管是從葉綠 素 a 提取的完全性、 測(cè)定數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、 試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性考慮等

7、方面來(lái)看， 包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 方法在內(nèi)的大多數(shù)方法， 存在操作耗時(shí)長(zhǎng)、過程復(fù)雜、葉綠素提取不完全的缺點(diǎn)； 而以丙酮加熱法測(cè)量葉綠素 a的提取效率高、數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，操作耗時(shí)短、簡(jiǎn)便，可推薦作為一種常用的浮游植物葉綠素 a的測(cè)量方法，尤其是應(yīng)急監(jiān)測(cè)或大批量水環(huán)境樣品測(cè)定時(shí)更顯現(xiàn)優(yōu)勢(shì)（表 1）。表1不同提取方法實(shí)驗(yàn)耗時(shí)情況測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)方法延時(shí)提取 法熱丙酮法反復(fù)凍融 法超聲提取 法丙酮加熱 法熱乙醇法混合溶劑 法-1P /（ L ）0.9741.0111.2161.4351.5171.6351.0261.397標(biāo)準(zhǔn)方差0.1490.1630.1570.0640.2530.0720.0770.126變異系

8、數(shù)15.716.014.73.9116.53.265.249.42實(shí)驗(yàn)耗時(shí)/h8-8.57-7.59-9.524211.5-28-98-9丙酮加熱法測(cè)定的注意事項(xiàng)： 隨著水浴加熱過程溫度的升高， 丙酮的萃取能力得到增強(qiáng)， 而且提取過程耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，樣品基本沒有損失。但在實(shí)驗(yàn)過程中，加熱的時(shí)間與溫度 控制很重要，且需要采取避光措施。溫度過高、有光照條件以及加熱時(shí)間過長(zhǎng)，均可能破壞葉綠素a的穩(wěn)定性。四、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：待測(cè)浮游藻；本實(shí)驗(yàn)采用藍(lán)藻產(chǎn)毒銅綠微囊藻（左）與綠藻一一蛋白核小球藻（右）。儀器設(shè)備：5mL或1mL移液槍、5mL或1mL槍頭、10mL離心管、離心機(jī)、錫箔紙、水浴鍋、

9、溫度計(jì)、10mL刻度試管、比色皿、分光光度計(jì)。試劑：80%丙酮。五、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)一、確定藻密度的藍(lán)藻藻液。用移液槍吸取2mL藍(lán)藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min,用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹 10mL離心管，并置于光線較暗處 55oC水浴放置30min,后于12000rpm離心5min ,吸出上清液轉(zhuǎn) 移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL,測(cè)定663nm處的光吸收值，測(cè)定結(jié)果按照 CA=OD663/82,計(jì)算出葉綠素的含量 （mg/L）。實(shí)驗(yàn)二、確定藻密度的綠藻藻液。用移液槍吸取2mL綠藻液置于10mL離心管中，于1

10、2000rpm離心5min,用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹 10mL離心管，并置于光線較暗處 55oC水浴放置60min,后于12000rpm離心5min ,吸出上清液轉(zhuǎn) 移至10mL刻度試管中，并用80%酮定容于5mL，測(cè)定663nm處的光吸收值，測(cè)定結(jié)果按照 CA=A663/82，計(jì)算出葉綠素 a的含量（mg/L）。用移液槍吸取2mL綠藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min，用移液槍吸去 上清液。藻餅于 2mL 80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55oC水浴放置30min，后于12000rpm離心

11、5min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至 10mL刻度試管中, 并用80%丙酮定容于5mL，測(cè)定663nm 645nm 652nm處的光吸收值，測(cè)定結(jié)果按照三色法 公式，可計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素的含量（mg/L）。根據(jù)下式，計(jì)算出原藻液中各葉綠素的含量（mg/L）：Chi (mg/L)二C（mg/L）提取液總量（L）初始體積（L）根據(jù)下式，計(jì)算出不同藻液中單個(gè)細(xì)胞各葉綠素的含量（g/個(gè)細(xì)胞）:Chl(g/細(xì)胞-1 )=C（mg/L）提取液總量（L）藻細(xì)胞總數(shù)（個(gè)）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 在不同波長(zhǎng)下分別測(cè)藍(lán)藻和綠藻的吸光度，數(shù)據(jù)記錄如下表:663nm645nm652nm藍(lán)藻0.772一一綠藻0.052

12、0.0290.039對(duì)藍(lán)藻的葉綠素計(jì)算用公式Ca=OD663/82，計(jì)算結(jié)果見下表 45.6對(duì)綠藻的葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素分別用公式：Ca(mg/L)=12.7A 663-2.69A645Cb(mg/L)=22.9A 645-4.68A663CT(mg/L)=A 652X1000/34.5計(jì)算結(jié)果如下表：葉綠素a (mg/L)葉綠素b (mg/L )總?cè)~綠素（mg/L）藍(lán)藻0.0094一0.0094綠藻（三色法）0.58240.42071.0031綠藻（單色法）0.63410.63601.2701根據(jù)下式，計(jì)算出原藍(lán)藻和綠藻溶液中各葉綠素的含量（mg/L）:Chi (mg/L)二C（mg

13、/L）提取液總量（L）初始體積（L）結(jié)果見下表:葉綠素a（ mg/L）葉綠素b（ mg/L）總?cè)~綠素（mg/L）藍(lán)藻0.0235一0.0235綠藻1.45601.05182.5078根據(jù)下式，計(jì)算出藍(lán)藻和綠藻中單個(gè)細(xì)胞各葉綠素的含量（g/個(gè)細(xì)胞）：Chl（g/細(xì)胞-1）=沁藻細(xì)胞總?cè)∫嚎偭可剿{(lán)藻藻液密度為3.3x107個(gè)/mL ,即每毫升藍(lán)澡澡液中含有3.3x107個(gè)藍(lán)藻細(xì)胞。綠藻藻液密度為8.4x107 個(gè)/mL ,即每毫升綠澡澡液中含有8.4x107個(gè)綠藻細(xì)胞。結(jié)果見卜表：葉綠素a （ g/細(xì)胞）葉綠素b （g/細(xì)胞）總?cè)~綠素（g/細(xì)胞）藍(lán)藻7.1x10-13一-137.1x10綠藻-111.735x10-111.252x10 11-112.987x10 11七、結(jié)果與討論（1）請(qǐng)說明藍(lán)藻只采用單色法測(cè)定葉綠素的原因。單色分光光度法測(cè)定葉綠素含量時(shí)，要測(cè)定665和750nm處的吸光度。藍(lán)藻只含有葉綠素a，不含有葉綠素b,所以只采用單色法測(cè)定葉綠素。（2 ）請(qǐng)比較綠藻單色法與三色法測(cè)定結(jié)果的差異，并說明理由。從單色法與三色法的測(cè)定結(jié)果比較得出，一般單色法測(cè)定的Chl-a的數(shù)值要高于三色法。因?yàn)?，單色法?jì)算所得的葉綠素a的含量是在663nm處所有吸光的葉綠素含量，不僅僅包括葉綠素a，還有部分葉綠素b，而三色法計(jì)算所得的葉綠素a減去了在663