蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾

1、蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾胡 濤中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾1.迅速被體內(nèi)酶降解2.腎小球過(guò)濾清除3.抗原抗體反應(yīng)4.溶解度差導(dǎo)致沉淀蛋白質(zhì)藥物在使用中出現(xiàn)的問(wèn)題TC實(shí)際濃度理想濃度蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過(guò)濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時(shí)間水解，緩慢釋放藥物 +蛋白或多肽偶聯(lián)物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾分離工程反應(yīng)工程劑型工程生物醫(yī)藥生物

2、能源生物材料生物化學(xué)品其它產(chǎn)品生化工程（生物化學(xué)工程，Biochemical Engineering）蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾目 錄 PEG修飾的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 PEG修飾劑的研發(fā) PEG修飾方法 PEG修飾工藝的優(yōu)化 PEG修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾一、PEG修飾的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾國(guó)際上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展n美國(guó)Rutgers大學(xué)Davis教授70年代的工作n甲氧基PEG的應(yīng)用n美國(guó)Enzon公司n美國(guó)最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司n美國(guó)Shearwaters公司n各種PEG修飾劑的生產(chǎn)商n美國(guó)羅氏、先靈寶雅、安進(jìn)nPEG藥物：PEG-IN

3、F，PEG-G-CSFn其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾國(guó)內(nèi)PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展n國(guó)家863重大機(jī)密項(xiàng)目：人工血液代用品的研制，1997-2000n中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目：血液代用品和血液凈化，2001-2005n國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)課題創(chuàng)新藥物和中藥現(xiàn)代化：長(zhǎng)效基因工程蛋白質(zhì)和多肽制劑關(guān)鍵技術(shù)，2002-2005n國(guó)家863重點(diǎn)項(xiàng)目課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術(shù)，2007-2010nPEG修飾血紅蛋白：I 期臨床n（中科院過(guò)程所、凱正公司）nPEG修飾G-CSF：III 期臨床n（格蘭百克）蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾修飾粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）延長(zhǎng)

4、半衰期修飾人腫瘤壞死因子消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長(zhǎng)半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性提高半衰期修飾人干擾素（IFN）提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb）血液代用品修飾胰島素提高半衰期我國(guó)在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾二、PEG修飾劑的研發(fā)蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾Sc-PEG 專(zhuān)利分析以PEG-OH為原料的必然途徑CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光氣 + NHS CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N

5、+ NH2G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF O單鏈修飾：(SC-PEG)蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾Roche公司的長(zhǎng)效干擾素產(chǎn)品專(zhuān)利分析同樣是以PEG-OH為原料的必然途徑 雙鏈修飾：蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾新的修飾策略采用新方法制備新的修飾劑以PEG-COOH（CM-PEG)為原料的必然途徑，已獲專(zhuān)利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N + NH2G-CSFOOO單鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSFO(CM-PEG)蛋白質(zhì)

6、藥物的PEG化學(xué)修飾我們的策略以PEG-COOH為原料的必然途徑CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO雙鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine OCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+ NH2IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NHIFN蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾1、PEG修飾劑的批量制備取得了成功取取 得得 的的 主主 要要 進(jìn)進(jìn) 展展mPEG-CH2CH2OH +TEMPO/KBrmPEG-CH2COOHNaC

7、lOice bath, H2Olys-OEt 2HClmPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2mPEG-CH2CONHCOOC2H5mPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2mPEG-CH2CONHCOOH0.1M NaOHmPEG-CH2CH2OH +TEMPO/KBrmPEG-CH2COOHNaClOice bath, H2OGlu(OEt)2HClTEADCC,NHSmPEG-CH2COO-NOOmPEG-CH2CONH-CHCH2CH2COOEtCOOEtmPEG-OH + Cl3C O COO Cl3+NHOOOO COOmPEGNOO+NNHClClOOmPEG-

8、OHOOOOO+mPEGmPEGbasedioxane,refluxacid50oCNHCOOHNaOHNHCOONaEOH+NCOOHCH2CH2OHml分枝型ZL 01141745.5l分叉(長(zhǎng)尾)型ZL 03100736.8l可逆型ZL03105003.4l不可逆型200410029577.1ZL02120740.2l異端基雙官能團(tuán)200410029577.1蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾聚乙二醇修飾劑產(chǎn)品產(chǎn)品號(hào)產(chǎn)品號(hào)末端基團(tuán)末端基團(tuán)分子量分子量包裝（包裝（g）價(jià)格價(jià)格（￥）（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPE

9、G-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羥基琥珀酰亞胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羥基琥珀酰亞胺20K1001053500070003500蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾三、藥用蛋白的PEG修飾方法蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾創(chuàng)新技術(shù)（反應(yīng)器技術(shù)和產(chǎn)物移

10、走技術(shù)）振蕩反應(yīng)器流加反應(yīng)器緩釋反應(yīng)器固相反應(yīng)方式膜耦合反應(yīng)方式雙水相反應(yīng)方式Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?00510114930.0 中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?410029577 1.修飾反應(yīng)器設(shè)計(jì)PEG-pellet 反應(yīng)器蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾吸附蛋白吸附蛋白加入加入PEGPEG修飾修飾洗脫洗脫2.固相吸附法制備PEG修飾蛋白蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾010203040PEG-SAKSolid PEG-SAK3222111Liquid P

11、EG-SAKSAKAbsorbance at 280 nmTime (min)固相吸附法與液相吸附法的比較1 1峰：原蛋白；峰：原蛋白；2 2峰：?jiǎn)涡揎椀鞍?；峰：?jiǎn)涡揎椀鞍祝?3 3峰：多修飾蛋白峰：多修飾蛋白蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾PEG-INF的制備過(guò)程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛3.PEG醛制備單修飾的藥用蛋白蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF)MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysin

12、es, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾 三批PEG30-rhG-CSF產(chǎn)品的制備取取 得得 的的 主主 要要 進(jìn)進(jìn) 展展序號(hào)序號(hào)產(chǎn)品批號(hào)產(chǎn)品批號(hào)試制日期試制日期試制量試制量12007080012007-8-52007-8-15共共3750 mg：6 mg/支，302支；3 mg/支，210支；1.5 mg/支，520支；6.6 mg/ml，80 ml22007090012007-9-82007-9-18共共1263 mg：3 mg/支，400支；3.15 mg/ml，20 ml32007100012007-10-920

13、07-10-21共共1422 mg：3 mg/支，400支；3.4 mg/ml，65 ml。PEG化重組人生長(zhǎng)激素，批產(chǎn)量1-10g；PEG化降纖酶，批產(chǎn)量6000支支；環(huán)孢素A眼用微乳制劑，批產(chǎn)量5000支支PEG化G-CSF2L修飾反應(yīng)器計(jì)算機(jī)程序控制批產(chǎn)量3g生產(chǎn)周期10天蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾修飾和劑型化產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量批次穩(wěn)定性-10-5051015202505101520Adsorbance at 280nmElution Volume, ml180190200210220230240250260-40-20020406080 IntensityWave

14、length (nm)1 2 3123123(A)(B)(C)以分子量為30kDa的PEG修飾rhG-CSF為例：(A)三批產(chǎn)品的SDS-PAGE檢測(cè)圖譜(B)三批產(chǎn)品的高效凝膠過(guò)濾檢測(cè)圖譜(C)三批產(chǎn)品的園二色檢測(cè)圖譜蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾4. 引入巰基的方法制備PEG修飾蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEG NO2-iminothiolaneNH2-Hb蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾Sangart公司是一家私營(yíng)的生物制藥公司，主公司是一家私營(yíng)的生物制藥公司，主

15、要從事氧載體的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化要從事氧載體的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化Hemospan - MP4 Phase I Sweden Status: CompletePhase Ib/II Sweden Status: CompletePhase II Sweden Status: Complete Phase II USA Status: Enrollment Complete Phase III Europe Status: Enrollment Complete 蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾010203040PEG-LyzLyzAbsorbance at 280 nmTime (min)該P(yáng)EG修飾產(chǎn)物的凝膠過(guò)

16、濾分析蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾四、PEG修飾工藝的優(yōu)化蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾PEG修飾反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化 建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，包括位點(diǎn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和蛋白分 子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間 優(yōu)化反應(yīng)的pH值 優(yōu)化PEG與蛋白的摩爾比 優(yōu)化反應(yīng)體系蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾pTimeppppp 蛋白分子的修飾反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem

17、. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾0481216020406080100PEGylation (%)Incubation time (h) Val-1 Lys-11 Lys-56PEG修飾的位點(diǎn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾010203040PEGylated SAKSAKAbsorbance at 280 nmTime (min)PEG醛修飾藥用蛋白的優(yōu)化反應(yīng)蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾單修飾產(chǎn)物的分離純化010203040506002040608010012014001020304050Conductivity(ms/cm)U

18、V280(mAU)Volume(mL) P1 P2蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾分離產(chǎn)物分析0510152005101520UV280 (mAU)Retention volume (mL) 6.514.3 29.0 66.420.1116 200 KDa44.3 P1 P2 P1凝膠過(guò)濾分析凝膠過(guò)濾分析蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾 膜耦合修飾工藝制備PEG化藥用蛋白蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾五、PEG修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾IEF和SDS-PAGE鑒定PEG修飾蛋白1234+-Iodine stainComassie blue stainSDS-PAGEIEF1: Marker,

19、 2: HbA, 3: -Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6-Hb1: HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6-Hb 1 2 3 4 4 5 5 94.0 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾20406080100120140 -T1 -T1Absorbance at 210 nmTime (min)RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾質(zhì)譜分析胰蛋白酶切片段2004006008001000020406080100120P

20、EG5K-y7y1y4y6y5y1y4V H L T P E E Ky6y7y5147.1502.2602.8716.4853.3Intensity (%)Mass (m/z)10002000300040005000600070000200400600800IntensityMALDI-TOF/TOF分析分析PEG修飾位點(diǎn)在修飾位點(diǎn)在Val-1( )蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾200210220230240250260-15000-10000-500005000 SAK PEGylated SAKdeg. cm 2.mol-1Wavelength (nm)30032034036038040004

21、008001200 Fluorescence intensityWavelength (nm) SAK PEGylated SAKPEG修飾蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定圓二色光譜鑒定圓二色光譜鑒定熒光光譜鑒定熒光光譜鑒定蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾1015202530050100150200Absorbance at 280 nmTime (min) PEG20K-SAK PEG30K-SAK PEG40K-SAKRP-HPLC分析PEG修飾蛋白蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾 蛋白質(zhì)修飾劑及其制備方法和用途,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL01141745.5 制備分枝型聚乙二醇的新方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL02120740

22、.2 帶PEG長(zhǎng)尾的蛋白質(zhì)修飾劑的制法和用途,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制備方法和其用途 ,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL 200310113367.6 重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的制備及其偶聯(lián)產(chǎn)物,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL 200410029577.1 一種蛋白質(zhì)交聯(lián)劑及其交聯(lián)方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL 03105003.4 一種分級(jí)分離制備血紅蛋白偶聯(lián)物的方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL 99106228.0 一種二醇聚合物動(dòng)物血紅蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL 99106229.9 一種二醇聚合物動(dòng)物血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利 ZL 00123

23、696.2 分子量均一的聚合物血紅蛋白的制備方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利 ZL 01136190.5. 血紅蛋白-人血清白蛋白偶聯(lián)物制備血液代用品及其制備方法,中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利， ZL 03109622.0PEG修飾的SCI論文Q Yun, T Chen, G Zhang, J Bi, G Ma , Z Su. A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-PEGylated protein. Biotech Lett, 27, 213-217, 2005 Q Yun, R Yang, T Chen,

24、J Bi, G Ma, Z Su. Reproducible preparation and effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel “PEG-pellet” PEGylation mode and ion-exchange chromatography. J Biotech. 2005, 118:67-74 Q Yun, M He, W Xing, J Bi, G Ma, Z Su, A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and intermolecular cross-linking of bovine hemoglobin, Biotech Lett 26: 1359-1363, 2004. X Li, F Meng, G Ma , Z Su, A simple and efficient method for synthesis of carboxymeth