色譜法的分類及其原理

1、色譜法的分類及其原理(一)按兩相狀態(tài)氣相色譜法：1、氣固色譜法 2、氣液色譜法液相色譜法：1、液固色譜法 2、液液色譜法(二)按固定相的幾何形式1、柱色譜法(column chromatography) :柱色譜法是將固定相裝在一金屬或玻璃柱中或是將固定相附著在毛細(xì)管內(nèi)壁上做成色譜柱，試樣從柱頭到柱尾沿一個(gè)方向移動而進(jìn)行分離的色譜法2、紙色譜法(paper chromatography ):紙色譜法是利用濾紙作固定液的載體，把試樣點(diǎn)在濾紙上，然后用溶劑展開，各組 分在濾紙的不同位置以斑點(diǎn)形式顯現(xiàn)，根據(jù)濾紙上斑點(diǎn)位置及大 小進(jìn)行定性和定量分析。3、薄層色譜法(thin-layer chromat

2、ography, TLC) :薄層色譜 法是將適當(dāng)粒度的吸附劑作為固定相涂布在平板上形成薄層，然后用與紙色譜法類似的方法操作以達(dá)到分離目的。(三)按分離原理按色譜法分離所依據(jù)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的不同，又可將其分為：1、吸附色譜法：利用吸附劑表面對不同組分物理吸附性能的差別而使之分離的色譜法稱為吸附色譜法。適于分離不同種類的化合 物（例如，分離醇類與芳香炫）。2、分配色譜法：利用固定液對不同組分分配性能的差別而使之分 離的色譜法稱為分配色譜法。3、離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來 測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組 分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差

3、異來實(shí)現(xiàn)分離。離子交換 色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應(yīng)用 于無機(jī)離子的分離，而且廣泛地應(yīng)用于有機(jī)和生物物質(zhì)，如氨基 酸、核酸、蛋白質(zhì)等的分離。4、尺寸排阻色譜法：是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法, 體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出 來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗 出色譜柱。這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中 流出。被廣泛應(yīng)用于大分子分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分 子質(zhì)量的分布。5、親和色譜法：相互間具有高度特異親和性的二種物質(zhì)之一作為 固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質(zhì)分離的 色譜法。

4、例如利用酶與基質(zhì)（或抑制劑）、抗原與抗體，激素與 受體、外源凝集素與多糖類及核酸的堿基對等之間的專一的相互 作用，使相互作用物質(zhì)之一方與不溶性擔(dān)體形成共價(jià)結(jié)合化合物， 用來作為層析用固定相，將另一方從復(fù)雜的混合物中選擇可逆地 截獲，達(dá)到純化的目的?？捎糜诜蛛x活體高分子物質(zhì)、過濾性病 毒及細(xì)胞?；蛴糜趯μ禺惖南嗷プ饔眠M(jìn)行研究。（四）按原理色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分 配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會不同，這使其隨 流動相運(yùn)動速度各不相同，隨著流動相的運(yùn)動，混合物中的不同 組分在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制，又可以分為吸 附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝

5、膠色譜、親和色譜等類別。1、吸附色譜：吸附色譜利用固定相吸附中心對物質(zhì)分子吸附能力 的差異實(shí)現(xiàn)對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子 與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程吸附色譜的分配系數(shù)表達(dá)式如下：K_a =fracX_aX_m其中Xa表示被吸附于固定相活性中心的組分分子含量，Xm表示游離于流動相中的組分分子含量。分配系數(shù)對于計(jì)算待分離 物質(zhì)組分的保留時(shí)間有很重要的意義。2、分配色譜：分配色譜利用固定相與流動相之間對待分離組分 溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑， 依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。分配 色譜過程本質(zhì)上是組分分子在固定想和流動相之

6、間不斷達(dá)到溶解 平衡的過程。分配色譜的狹義分配系數(shù)表達(dá)式如下：K=frac=fracX_s/V_sX_m/V_m式中Cs代表組分分子在固定相液體中的溶解度，Cm代表組分分子在流動相中的溶解度。3、離子交換色譜：離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜的固定相一 般為離子交換樹脂，樹脂分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中 心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成 離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的 固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交 換中心，并隨著流動相的運(yùn)動而運(yùn)動，最終實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜的

7、分配系數(shù)又叫做選擇系數(shù)，其表達(dá)式為：K_s=fracRXA+XA+其中RX + 表示與離子交換樹脂活性中心結(jié)合的離子濃度，X + 表示游離于流動相中的離子濃度。4、凝膠色譜：凝膠色譜的原理比較特殊，類似于分子篩。待分 離組分在進(jìn)入凝膠色譜后，會依據(jù)分子量的不同，進(jìn)入或者不進(jìn) 入固定相凝膠的孔隙中，不能進(jìn)入凝膠孔隙的分子會很快隨流動 相洗脫，而能夠進(jìn)入凝膠孔隙的分子則需要更長時(shí)間的沖洗才能 夠流出固定相，從而實(shí)現(xiàn)了根據(jù)分子量差異對各組分的分離。調(diào) 整固定相使用的凝膠的交聯(lián)度可以調(diào)整凝膠孔隙的大??；改變流 動相的溶劑組成會改變固定相凝膠的溶漲狀態(tài)，進(jìn)而改變孔隙的 大小，獲得不同的分離效果。5、吸附

8、色譜：吸附色譜利用固定相吸附中西對物質(zhì)分子吸附能力 的差異實(shí)現(xiàn)對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子 與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程。（五）按操作方式吸附薄層色譜法是指根據(jù)各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在移動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù) 的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分的互 相分離的目的。色譜法常見的方法有：柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高 效液相色譜法等。1、柱色譜：柱色譜法是最原始的色譜方法，這種方法將固定相 注入下端塞有棉花或?yàn)V紙的玻璃管中，將被樣品飽和的固定相粉 末攤鋪在玻璃管頂端，以流動相洗脫。常見的洗脫方式有兩種， 一種是自上

9、而下依靠溶劑本身的重力洗脫，一種是自下而上依靠 毛細(xì)作用洗脫。收集分離后的純凈組分也有兩種不同的方法，一 種方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一種方法是烘干固定相 后用機(jī)械方法分開各個(gè)色帶，以合適的溶劑浸泡固定相提取組分分子。柱色譜法被廣泛應(yīng)用于混合物的分離，包括對有機(jī)合成產(chǎn) 物、天然提取物以及生物大分子的分離。2、薄層色譜：薄層色譜法是應(yīng)用非常廣泛的色譜方法，這種色 譜方法將固定相圖布在金屬或玻璃薄板上形成薄層，用毛細(xì)管、 鋼筆或者其他工具將樣品點(diǎn)染于薄板一端，之后將點(diǎn)樣端浸入流 動相中，依靠毛細(xì)作用令流動相溶劑沿薄板上行展開樣品。薄層 色譜法成本低廉操作簡單，被用于對樣品的粗測、對有機(jī)合成

10、反 應(yīng)進(jìn)程的檢測等用途。3、氣相色譜：GC主要是利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及吸附性質(zhì)的差 異來實(shí)現(xiàn)混合物的分離，其過程如圖氣相分析流程圖所示。待分析樣品在汽化室汽化后被惰性氣體（即載氣，也叫流動 相）帶入色譜柱，柱內(nèi)含有液體或固體流動相，由于樣品中各組 分的沸點(diǎn)、極性或吸附性能不同，每種組分都傾向于在流動相和 固定相之間形成分配或吸附平衡。但由于載氣是流動的，這種平 衡實(shí)際上很難建立起來。也正是由于載氣的流動，使樣品組分在 運(yùn)動中進(jìn)行反復(fù)多次的分配或吸附 /解吸附，結(jié)果是在載氣中濃度 大的組分先流出色譜柱， 而在固定相中分配濃度大的組分后流出。 當(dāng)組分流出色譜柱后，立即進(jìn)入檢測器。檢測器能夠?qū)悠方M

11、分 的與否轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，而電信號的大小與被測組分的量或濃度成 正比。當(dāng)將這些信號放大并記錄下來時(shí)，就是氣相色譜圖了。氣 相色譜被廣泛應(yīng)用于小分子量復(fù)雜組分物質(zhì)的定量分析。4、高效液相色譜 ：高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引 用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓 力可達(dá)4.9'107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而 成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十 萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。 高效液相色譜（HPL。是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測 器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其